칩에 Lensless 형광 현미경

이 절차의 전반적인 목표는 초광시야 범위에서 형광 물체를 이미징하기 위한 렌즈리스 온칩 형광 현미경 플랫폼을 시연하는 것입니다. 이를 달성하기 위해, 얇은 흡수 필터와 광섬유 페이스 플레이트를 광전 센서 어레이(또는 CCDC CMOS) 위에 조심스럽게 배치한 후, 페이스 플레이트 위에 미세유체 칩을 위치시킵니다. 다음으로, 굴절률 매칭 오일을 사용하여 프리즘을 마이크로칩과 조립합니다.

형광 여기는 마름모꼴 프리즘의 측면을 통해 이루어지며, 홀로그래픽 조명은 동일한 프리즘의 상단면을 통해 수행됩니다. 최종적으로, 획득한 형광 이미지의 로우 데이터를 디지털 알고리즘으로 디코딩함으로써 고해상도 현미경 이미지를 얻을 수 있습니다. 필요한 경우, 맞춤 개발된 인터페이스를 사용하여 디코딩된 형광 객체를 자동으로 계수할 수 있습니다.

온칩 렌즈. 이미징의 일반적인 목표는 부피가 큰 렌즈 기반의 광학 현미경을 더 단순하고 소형화된 설계로 대체하는 것입니다. 이 신흥 기술 플랫폼은 새로운 이론과 디지털 재구성 알고리즘의 도움을 통해 부피가 크고 비용이 많이 드는 광학 부품의 필요성을 제거할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

온칩 이미징 플랫폼의 렌즈 목록은 디지털 센서 어레이, 비간섭성 조명원, 프리즘, 흡수 필터, 그리고 광섬유 페이스 플레이트 또는 광섬유 테이퍼를 포함하는 여러 광학 부품으로 구성됩니다. 이 플랫폼에서는 대상 미세 객체로부터의 형광 신호를 검출하기 위해 다양한 유형의 센서 어레이를 사용할 수 있습니다. 본 비디오에서는 전하 결합 소자를 사용하며, 형광 여기를 위해 단순 발광 다이오드와 같은 비간섭성 광원을 사용합니다.

이 도식에서 보듯이, 필요한 암시야 배경을 만들기 위해 두 가지 서로 다른 여기 필터링 방법이 병행하여 사용됩니다. 먼저, 유리 프리즘 또는 유리 반구를 사용하여 시료가 담긴 미세유체 칩의 바닥 표면에서 전반사 또는 TIR을 유도합니다. 이와 동시에, 저렴한 흡수 필터를 사용하여 TIR 과정이 적용되지 않고 약하게 산란되는 여기광을 제거합니다.

이 두 가지 메커니즘을 통해 들뜸광이 성공적으로 제거되면, 검출기 평면에서는 시료의 형광 방출만이 수집됩니다. 이처럼 검출 수치 구경이 큼에도 불구하고, 센서 어레이의 가공되지 않은 형광 스팟은 형광 신호의 공간적 확산을 설계하고 더 잘 제어하기 위해 상당히 넓게 형성됩니다. 일반적인 페이스 플레이트의 대안으로, 물체 평면과 센서 평면 사이에 광섬유 페이스 플레이트가 배치됩니다.

상단 단면의 광섬유 케이블 밀도가 하단 단면보다 현저히 높은 테이퍼드 광섬유 페이스 플레이트를 사용하면 배율을 높여 고해상도 이미징을 구현할 수 있습니다. 이 플랫폼에 사용되는 미세유체 칩은 유리 슬라이드 위에 poly dimethyl Sloane 벽을 배치하여 제작하며, 이를 통해 온칩 이미징에 필요한 미세 채널을 형성하여 렌즈리스 온칩 이미징 플랫폼의 조립을 시작합니다. 먼저, 진공 펜을 사용하여 광전자 센서 어레이의 커버 글라스를 제거한 다음, 검출기 활성 영역 상단에 얇은 흡수 필터를 조심스럽게 배치합니다.

이 흡수 필터 위에 광섬유 페이스 플레이트를 배치합니다. 그 다음, 제작된 미세유체 칩을 광섬유 어레이 위에 직접 놓습니다. 다음으로, 계면의 굴절률이 유리의 굴절률과 일치하도록 굴절률 매칭 오일을 사용하여 미세유체 칩 위에 유리 프리즘을 조립합니다.

FC 커넥터를 사용하여 광원을 광섬유 케이블에 연결하십시오. 이 절차에서 가장 어려운 부분 중 하나는 구성 요소들의 정렬입니다. 구성 요소 간의 거리, 조명의 위치 및 각도를 세심하게 정렬하십시오.

마지막으로, 측면 조명 파이버를 프리즘에 더 가깝게 이동시키고 각도를 조절하여 미세유체 칩에 해당하는 유리-공기 계면에서 전반사가 일어나는지 확인하십시오. 이 온칩 플랫폼을 사용하여 바닥 기질, 다양한 세포 또는 소동물 모델을 이미징할 수 있으며, 본 시연에서는 백혈구를 이미징하겠습니다. 형광 염료로 백혈구를 표지하려면, 먼저 전혈 약 100 µL를 적혈구 세척 완충액 약 1 mL와 혼합하여 상온에서 약 3분간 배양한 다음, 용혈된 혈액 용액을 원심 분리하십시오.

마이크로 파이펫을 사용하여 상층액을 제거한 후, 세포의 핵산을 형광 염료로 표지하기 위해 펠릿 층을 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline)로 재현탁하십시오. 재현탁액에 SYTO 16을 첨가하고, 샘플을 실온의 암소에서 약 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 표지된 샘플을 원심 분리하십시오. 결합되지 않은 염료의 형광 방출로 인한 배경 소음을 줄이기 위해 상층액을 제거합니다.

Reese는 약 5 mL의 PBS로 백혈구 펠렛 층을 현탁시켰습니다. 이제 이 시료는 렌즈리스 온칩 형광 이미징을 위해 미세유체 칩에 로딩될 준비가 되었습니다. 백혈구를 이미징하기 전, 형광 마이크로비즈를 사용하여 이미징 플랫폼을 보정해야 합니다.

탈이온수와 원액 비드 용액을 사용하여 희석된 마이크로비드 시료를 준비합니다. 날카로운 바늘 주사기를 사용하여, 이 초기 시료를 PDMS 벽면 쪽에서 마이크로플루이딕 칩 내부로 주입합니다.

온칩 형광 이미징을 위해 구성 요소를 조립한 후, 컴퓨터의 커스텀 개발 lab view 인터페이스를 사용하여 형광 비드의 로우 이미지를 획득합니다. 전체 시야 범위 내에 최소 20개의 분리된 형광 비드 이미지가 있는지 확인하십시오. 이후 렌즈리스 형광 현미경 플랫폼의 점 확산 함수(point spread function)를 보정하고 추출하는 데 사용할 보정 데이터를 저장합니다.

형광 비드 샘플이 포함된 미세유체 칩을 제거하고 이 칩에서 프리즘을 분리합니다. 이전에 준비한 백혈구 샘플을 PDMS 벽면 쪽에서 사용하지 않은 다른 미세유체 칩에 주입합니다. 거리와 여기 출력 등 동일한 실험 조건으로 구성 요소를 다시 조립합니다.

형광 마이크로비즈에 사용했던 것과 동일한 소프트웨어 파라미터를 적용한 맞춤형 LabVIEW를 사용하여 백혈구의 원본 이미지를 획득합니다. 이후 보정 데이터와 백혈구 원본 이미지를 MATLAB을 통한 디지털 프로세싱에 사용하여 더 높은 해상도의 이미지를 생성합니다. 비교를 위해 4 µm 및 10 µm 녹색 형광 입자가 포함된 혼합물의 광시야 렌즈 온칩 형광 이미징의 대표적인 결과가 10배 현미경 배율로 여기에 제시되어 있습니다.

대물렌즈 이미지 또한 제공되며, 이는 제시된 무렌즈 형광 이미지와 잘 일치합니다. 다음은 10 micron 녹색 및 10 micron 적색 형광 입자가 포함된 혼합물의 광시야 무렌즈 형광 이미징 결과입니다. 무렌즈 형광 이미지는 동일한 시료의 10x 현미경 대물렌즈 이미지와 상당히 유사하게 나타납니다.

이 그림은 다양한 10 micron 비드 쌍의 이미징에 대해 Lucy Richardson Deconvolution과 디코딩 알고리즘 기반의 압축 샘플링 성능을 비교하여 보여줍니다. 첫 번째 줄은 렌즈 없는 원본 형광 이미지를 보여주며, 삽입된 이미지는 10x 대물렌즈를 사용하여 촬영한 동일한 입자들의 현미경 비교 사진입니다. 두 번째 줄은 압축 디코딩 결과를 나타내며, 세 번째 줄은 Lucy Richardson Deconvolution 결과를 보여줍니다. DDCS와 DLR은 각각 중심 간 거리와 현미경 이미지, CS 디코딩 렌즈 이미지, 그리고 LR 디컨볼루션 렌즈 없는 이미지를 나타냅니다.

다음으로, 렌즈의 디지털 처리 과정과 형광 강도가 낮은 원본 이미지들이 설명됩니다. 압축 샘플링 기반 알고리즘을 사용하여, 밀집하게 배치된 2 µm 직경의 비드 쌍을 분해함으로써 4 µm 미만의 공간 분해능을 구현합니다. 삽입도는 40배 현미경 대물렌즈 비교 영상을 보여주며, 이는 디코딩된 형광 이미지와 매우 잘 일치합니다.

여기서 D는 현미경 이미지의 중심 간 거리를 나타냅니다. 반면 DCS는 CS 디코딩된 렌즈리스 이미지의 중심 간 거리를 나타냅니다. 이 그림은 형광 표지된 백혈구의 렌즈리스 이미징 결과를 보여줍니다.

원시 렌즈리스 이미지는 CS 기반 디코더를 사용하여 빠르게 디코딩되며, 이는 10x 대물렌즈로 획득한 동일 샘플의 기존 현미경 이미지와 매우 잘 일치합니다. 필요 시 이미징뿐만 아니라, 디코딩된 형광 객체는 온칩 사이토메트리(on-chip cytometry) 응용 분야를 위해 맞춤 개발된 인터페이스를 사용하여 자동으로 계수될 수 있습니다. 여기에는 MATLAB으로 맞춤 설계된 자동 형광 객체 계수 인터페이스가 예시되어 있습니다. 우리는 8cm²의 시야 범위에서 라벨링된 세포와 마이크로 비즈의 렌즈리스 형광 현미경 관찰 절차를 입증하였습니다.

이와 같은 비교 칩 이미징 플랫폼은 그 배후에 신속 압축 디코더(rapid compressive decoder)를 갖추고 있습니다. 이는 고처리량 사이토메트리, 미세 희귀 분석 및 실제 세포 연구 응용 분야에서 매우 유용하게 활용될 것입니다.