Compartmentalizing 마이크로 유체 장치와 라이브 세포 이미징을 사용하여 암 줄기 세포 마이그레이션 평가

본 절차의 전반적인 목표는 구획화된 미세유체 장치를 통해 암세포의 이동을 시각적으로 관찰하고 특성화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 무혈청 배지에서 배양된 뇌종양 줄기세포의 기존 뉴로스피어(neurosphere)를 분리합니다. 두 번째 단계로 이층 구조의 SU-8 마스터를 제작하고, 소프트 리소그래피를 이용해 구획화 설계가 적용된 PDMS 스탬프를 제작합니다.

다음으로, 미세유체 장치를 조립하고 뇌종양 줄기세포를 주입합니다. 마지막으로, 올인원 현미경 시스템을 사용하여 뇌종양 줄기세포 이동의 장기 타임랩스 이미징을 수행합니다. 최종적으로, 결과는 뇌종양 줄기세포가 초미세 제한 공간을 통해 이동하는 동안 형태학적 단계의 회전 서열을 나타냄을 보여줍니다.

Transwell Boyton Chamber와 같은 기존 방식에 비해 이 기술의 주요 장점은, 마이크로 장치를 통해 세포의 이동 과정을 시각적으로 검사하고 세포를 제어하여 배치하며 인자를 정밀하게 전달할 수 있다는 점입니다. 따라서 마이크로 유체 기술은 신뢰할 수 있고 효율적이며 비용 효과적인 단일 세포 선택 및 탐색 기능을 갖추고 있습니다. 높은 이동성을 가진 세포에 대한 단일 세포 분석을 통해 향후 잠재적인 화학요법 표적을 식별할 수 있으므로, 이 기술의 영향은 암 전이 및 재발 치료로까지 확장됩니다.

이 방법은 암 시스템의 이동 행동에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 배아 발달, 면역 반응, 상처 치유 및 장기 재생과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. BTSC 유래 신경구(neurospheres)의 세포 현탁액으로 시작합니다. 세포를 15 mL 원심분리관(conical tube)에 모으고 900 RPM에서 5분 동안 원심분리하되, 이보다 빠르게 회전시키지 마십시오.

상청액을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 37°C에서 5~10분 동안 0.5 mL의 예열된 Accutane으로 배양하여 뉴로스피어(neurospheres)를 느슨하게 분리합니다. 배양 후, P100 피펫으로 10~20회 부드럽게 파이펫팅하여 세포를 기계적으로 분쇄합니다.

그 다음, Accutane 원심분리기를 중화시키기 위해 줄기세포 배지 1.5 milliliters를 추가하고, 세포 현탁액을 1300 RPM에서 5분 동안 원심분리한 후 세포를 줄기세포 배지 1 milliliter에 다시 현탁합니다. 혈구계수기로 세포 밀도를 확인하고 밀도를 microliter당 20,000 cells로 조정합니다. SU-8 마스터 제작을 시작하기 위해, Adobe Illustrator와 Image Setter가 통합된 레이저 프린팅 투명 필름을 사용하여 두 개의 포토마스크를 준비합니다.

첫 번째 층 포토마스크는 두 개의 기준 마커와 마이크로 채널 배열로 구성되며, 두 번째 층 포토마스크에는 안착 및 수집 챔버가 있습니다. 두 마스크 층을 이소프로판올로 세척한 후 공기 중에서 건조시킵니다. 이제 핸들 웨이퍼에 3 µm 두께의 SU-8 포토레지스트를 스핀 코팅하고 소프트 베이킹을 수행합니다.

그 다음, 첫 번째 레이어 포토 마스크를 밀착시킨 상태에서 uv 노광을 통해 포토레지스트를 노출시키고 경화시킵니다. 이후 웨이퍼를 포스트 베이크하고 현상합니다. 핸들 웨이퍼의 피듀셜 마커 영역을 스카치테이프로 덮습니다.

그런 다음 웨이퍼에 250 micron 두께의 포토레지스트를 스핀 코팅합니다. 그 후, 정렬 목적의 마커가 드러나도록 테이프를 제거합니다. 두 번째 포토레지스트 층을 도포하고 피듀셜 마커를 정렬합니다.

그 다음, 두 번째 층 포토마스크를 UV 노광 및 경화시킨 후 포스트 베이킹과 현상을 진행합니다. 이제 표면의 끈적임을 줄이기 위해 증착법을 통해 SU-8 마스터를 처리합니다. 웨이퍼를 진공 상태의 데시케이터에 넣고 Tri Chloro cline 용액을 몇 방울 떨어뜨려 최소 1시간 동안 둡니다.

이제 마스터를 사용하여 PDMS를 성형할 준비가 되었습니다. 먼저 프리폴리머 베이스와 경화제를 10:1 비율로 충분히 혼합하십시오. 그 다음, 기포가 더 이상 보이지 않을 때까지 혼합물을 데시케이터에 넣고 진공 탈포합니다.

혼합물을 마스크 위에 붓고 다시 탈포합니다. 새로운 기포가 발생한 경우, 수평이 맞는 핫플레이트에서 90 °C로 2시간 동안 몰드를 경화시킵니다. 실온으로 식힌 후, PDMS 스탬프를 조심스럽게 떼어냅니다.

이로써 PDMS에 배양 채널이 각인되었으며, 미세유체 장치를 조립할 준비가 되었습니다. 마스터는 균열이 생기거나 마모될 때까지 몰딩에 재사용할 수 있습니다. 마스터 표면이 끈적거리는 경우, 비점착 코팅을 다시 도포할 수 있습니다.

PDMS 스탬프를 사용하여 미세유체 장치에 입구와 출구를 만드는 것으로 시작합니다. 생검 천자침(biopsy hole puncture)을 사용하여 PDMS 스탬프를 70% ethanol에 30분 동안 담가 세척한 후, 탈이온수로 10분 동안 헹굽니다. 오토클레이브(autoclaving)를 통해 PDMS 스탬프를 멸균하고 가교 반응을 완료합니다.

이제 poly L lysine이 코팅된 유리 커버슬립 위에 PDMS 스탬프를 놓습니다. 그 다음 리저버 입구를 통해 챔버에 라미네이트 용액을 채워 장치를 라미네이트로 코팅하고, 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 장치에서 라미네이트를 흡입하여 제거합니다.

그런 다음 줄기세포 배지를 두 번 가득 채워 장치를 세척합니다. 이제 분리된 세포 11 µL를 시딩 리저버 중 하나에 로딩합니다. 필요한 경우, 진공 흡입을 사용하여 세포를 챔버 안으로 강제로 밀어 넣습니다. 그런 다음 인접한 시딩 리저버에 세포 7 µL를 추가로 로딩합니다.

5분 후, 시팅 및 수용 리저버(reservoir)에 배지가 가득 채워집니다. 이제 0.5에서 1mm 두께의 멸균된 PDMS 시트를 장치 위에 올립니다. PDMS 자체의 자연적인 표면 접착력으로 장치가 밀봉되며, 밀봉이 완료되면 운송, 배양 및 현미경 이미지 촬영을 위한 준비가 끝납니다.

biot, IM을 45분 동안 가동하여 미리 평형 상태로 만듭니다. 온도, 습도 및 공기 공급을 안정시키기 위해 샘플 챔버에 물 접시를 여러 개 넣어 적절한 습도를 유지합니다. 준비된 장치를 현미경의 샘플 챔버에 장착합니다.

마이크로 핀셋을 사용하여 장치를 중앙에 맞춥니다. 이제 Biot 소프트웨어를 사용하여 초점 위치 지점과 시간 지점을 설정하고, 필요한 경우 타임랩스 기록을 시작합니다. 배양 5일 후에 배양액을 교체합니다.

장치에 파종된 BTC는 위상차 이미지로 지속적으로 기록되었습니다. 안착 챔버 내에서의 5일 동안, 방추형 세포들은 전-이동 단계에 머물러 있었습니다. 세포들이 마이크로채널 입구에 접근함에 따라, 일부 세포들이 확장되며 접착성 돌기를 생성하였습니다.

단 하나의 세포만이 입구에 위치하여 이동 방향을 탐색할 수 있었습니다. 세포가 이동 방향을 결정하자, 일정한 고속으로 마이크로채널 전체를 통과하여 이동했습니다. 마이크로채널의 끝에서 세포는 수신 챔버(receiving chamber)의 개방된 공간을 탐색한 후 최종적으로 챔버 내부로 진입했습니다.

두 번의 2차 이미징 간격으로 세포를 관찰한 결과, 이동력은 주로 OID 세포와 유사한 블래빙(blabbing) 활동에 의해 생성되는 것으로 나타났습니다. 실험 절차를 수행할 때, 장치의 설계가 매우 유연하여 원하는 수준의 세포 이동을 달성하기 위해 마이크로채널의 치수를 조절할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 관심 있는 세포를 배양하는 데 적합한 독특한 구획화 마이크로유체 장치를 제작하는 방법과, 본 절차에 따라 이러한 세포의 이동 특성을 정성적 및 정량적으로 정의하기 위한 장기 타임랩스 이미징을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

고이동성 암세포가 유전적으로 얼마나 다른지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing)이나 DNA 마이크로어레이(DNA microarray)와 같은 다른 방법들을 적용할 수 있습니다.