Oligonucleotide - 결합 형광등 Microspheres를 사용하여 복잡한 임상 및 환경 샘플에서 박테리아의 멀티 플렉스 감지

안녕하세요, 캐나다 농업농식품부의 Tim Duso입니다. 본 영상에서는 Bio-Plex 기기를 사용하여 복잡한 임상 또는 환경 시료 내 특정 미생물의 존재 여부와 풍부도를 결정하는 프로토콜을 시연하겠습니다. 이 프로토콜은 종 특이적 올리고뉴클레오타이드 프로브가 화학적으로 결합된 형광 폴리스티렌 비드를 사용합니다.

범용 PCR 프라이머를 사용하여 샘플로부터 앰플리콘을 생성하고, 이 앰플리콘을 프로브가 결합된 비드에 하이브리드화합니다. Bio-Plex 장비를 통해 두 가지 신호가 생성되는데, 하나는 비드를 식별하고 다른 하나는 하이브리드화 신호를 정량화합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 관심 있는 미생물군집의 프로필을 신속하고 반정량적인 방식으로 결정하는 것입니다. 본 연구에서는 질 스왑의 박테리아 프로필을 결정하기 위해 이 기술을 적용하였으며, 생성된 데이터를 사용하여 세균성 질염을 진단하였습니다. 세균성 질염은 lactobacillus 균의 유병률이 낮아지고 Gardnerella, vais 및 apoian vae와 같은 다른 균들이 질 스왑에서 검출되는 미생물군집의 변화를 특징으로 하는 임상 상태입니다. 하지만 이 기술은 신속한 멀티플렉스 분석이 필요한 다른 모든 미생물군집에도 적용될 수 있다는 점을 유념하는 것이 중요합니다.

먼저 이 실험 절차의 작동 원리에 대해 설명하겠습니다. 면봉으로 채취한 DNA 추출물 내에 존재하는 모든 생물체로부터 단백질 및 코팅 유전자 샤페론 60을 증폭하여 미생물 프로필을 생성합니다. 범용 증폭 프라이머 중 하나는 비오틴을 추가하고 인산화 변형 염기를 포함시켜 변형되었습니다.

5' 말단에서, T7 exonuclease를 사용하여 앰플리콘을 단일 가닥으로 만드는데, 이 효소는 오직 antisense 가닥만 분해합니다. sense 가닥은 인산화 변형된 PCR 프라이머에 의해 보호되므로, 남은 가닥에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 프로브가 형광 폴리스티렌 비드에 공유 결합됩니다. 각 고유한 비드 색상이 서로 다른 생물체를 검출하는 프로브를 포함하고 있어, 단일 샘플에 최대 100가지의 서로 다른 비드를 사용할 수 있습니다.

질 면봉에서 얻은 단일 가닥 PCR 생성물을 관심 대상인 모든 미생물의 프로브가 포함된 프로브 결합 비드 혼합물에 하이브리드화합니다. 이후 스트렙타비딘 접합체를 통해 비오틴화된 프로브에 결합하는 형광 리포터 FICO ethin을 첨가합니다. 마지막으로, 하이브리드화 혼합물을 luminex 또는 bio plex 장비로 분석하여 각 비드의 정체성과 하이브리드화 신호를 개별적으로 검사합니다.

이 분석 결과는 특정 미생물의 존재 여부를 나타내며, 하이브리다이제이션 신호의 강도는 해당 미생물의 풍부도와 상관관계가 있습니다. 샘플 내에서 BV 관련 미생물의 존재는 bv를 진단하는 데 사용될 수 있습니다. 그람 염색과 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 특정 미생물의 존재와 그 풍부도에 대한 정보를 생성한다는 점입니다.

우리 실험실의 연구 보조원인 Jennifer Town이 절차를 시연하겠습니다. 마이크로스피어를 약 20초 동안 볼텍싱하여 재현탁합니다. 마이크로스피어 400 µL를 원심분리 튜브로 옮겨 14,000 ×g에서 1분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 버립니다. 마이크로스피어를 0.1 M MES pH 4.5 50 µL에 재현탁합니다.

캡처 올리고(capture oligo) 1 nmol을 마이크로스피어에 첨가하고 볼텍싱하여 섞습니다. 신선한 EDC 용액 2.5 µL를 마이크로스피어에 첨가합니다. 반응물을 암실 내 상온에서 30분 동안 배양합니다.

이전에 준비한 EDC 용액을 폐기하고 10 mg/mL 농도의 신선한 EDC 수용액 샘플을 준비합니다. 앞서 수행한 것과 같이, 신선한 EDC 용액 2.5 µL를 마이크로스피어에 추가하고 5초 동안 볼텍싱합니다. 암실 상태의 상온에서 30분 동안 다시 배양합니다.

0.02% Tween 20 1mL을 첨가하여 비드를 세척하고, 볼텍스(vortex)로 비드를 재현탁한 후 14,000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 버립니다. 0.1% SDS 1mL을 첨가하여 비드를 다시 세척합니다. TE 버퍼 100µL에 비드를 재현탁합니다.

스톡 농도를 결정하기 위해 혈구계수기(hemo cytometer)로 비드 수를 측정합니다. 각 비드를 TE 완충액 풀에서 마이크로리터당 100개의 비드가 되도록 최종 농도로 희석하여 마이크로스피어 마스터 믹스를 준비합니다. 분석에 필요한 멀티플렉스(plex) 수에 따라 결합된 비드들을 혼합합니다. 마이크로스피어 마스터 믹스는 4°C의 암소에 보관하십시오. 이러한 조건 하에 보관하면 이 혼합물을 수개월 동안 보관할 수 있으며, 이후 각 샘플에 대한 PCR 산물을 생성합니다.

PCR이 완료된 직후 포스포레이트(phospholate) 및 비오틴(biotin)이 수식된 5' 프라이머 세트를 포함시킵니다. 각 PCR 튜브에 T7 exonuclease 2 µL를 추가하고 실온에서 40분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 0.5 M EDTA (pH 8.0) 혼합액 12.5 µL를 추가합니다.

이를 통해 총 약 64.5 µL의 단일 가닥 PCR 생성물을 얻습니다. 피펫을 사용하여 Resus Bend Microsphere 마스터 믹스를 재현탁합니다. 적절한 양을 에펜도르프 튜브에 분주합니다.

튜브의 캡을 닫고 워터 배스 소니케이터(water bath sonicator)에서 2분 동안 초음파 처리합니다. 단일 가닥 PCR 산물 17 µL를 로우 프로파일(low profile) 96-웰 플레이트의 해당 웰에 분주하고, 각 웰에 재현탁된 소니케이션 비드 혼합물 33 µL를 추가합니다.

플레이트를 실리콘 커버로 덮고 가볍게 두드립니다. 95°C에서 5분, 60°C에서 10분, 60°C에서 유지 또는 60°C에서 5분간 일시 정지하도록 설정된 프로그램이 입력된 써모사이클러에 플레이트를 조심스럽게 넣습니다. 종료 후 프로그램을 시작합니다.

신선한 strep Aden FICO Ethin 용액을 조제하십시오. 웰당 25 µL가 필요합니다. stalk을 1 mg/mL 농도로 희석하여 strep 및 FICO ethin을 조제하십시오.

1x tmac 버퍼를 사용하여 1mL당 50에서 20µg의 농도로 조제합니다. 써모사이클러(Thermocycler)가 60°C 유지 단계에 도달하면 뚜껑을 열고 실리콘 커버를 제거한 후, 각 웰(well)에 strep din FICO ethin 용액을 직접 첨가합니다. 실리콘 커버를 다시 덮고 써모사이클러 뚜껑을 닫은 후 프로그램을 재개합니다.

프로그램이 완료되면 플레이트를 꺼내어 신속하게 Bio-Plex 기기로 옮겨 측정합니다. 플레이트는 10분 이내에 측정해야 합니다. 플레이트를 60°에서 측정하십시오.

Bio-plex가 이 온도로 예열되었는지 확인하십시오. 이는 단일 개체로부터 시점 0에 채취한 종단적 샘플의 해당 그람 염색 및 Luminex 프로필 결과를 보여줍니다. 그람 염색 결과는 BV의 임상 진단과 일치하며, 이는 Gardnerella vaginalis 및 Atopobium vaginae를 포함하여 BV 관련 미생물에 대해 양성 하이브리드화 신호를 보이는 Fiveplex Luminex 분석을 통해 뒷받침됩니다.

시간이 경과함에 따라 Lactobacillus Iners 또한 낮은 수준으로 검출됩니다. 그람 염색 결과에서 나타나듯, 이 피험자는 BV 미생물군집에서 정상 미생물군집으로 전이됩니다. 동일한 샘플에 대한 Luminex 분석 결과, Gardnerella Vaginalis의 풍부도는 정점에 도달했다가 감소하며, Lactobacillus Iners는 증가하여 최종 시점에서 우점종이 됨을 보여줍니다.

이 방법을 사용하여 마이크로바이오타 프로파일링을 수행하면 특정 미생물의 존재 여부뿐만 아니라 그 풍부도에 대한 정보가 생성됩니다. 이 방법은 시퀀싱 기반이므로, 딥 시퀀싱 분석을 통해 프로브 설계를 최적화할 수 있으며, 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing) 방법으로 확인된 미생물을 신속하고 상대적으로 저렴한 비용으로 샘플 내에서 추적할 수 있습니다. 이 영상을 통해 Luminex 또는 Bio Plex 장비를 사용하여 샘플에서 미생물 프로파일을 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다.

올리고뉴클레오타이드 프로브를 형광 비드에 결합하는 방법, 임상 또는 환경 샘플로부터 단일 가닥 DNA를 생성하는 방법, 하이브리드화를 수행하는 방법, 그리고 Luminex 또는 Bio Plex 장비로 결과를 판정하는 방법을 살펴보았습니다. 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.