높은 명령으로 Nanosheets에 Peptoid 폴리머 및 자기 조립의 고체 상 합성 Submonomer

이 절차의 전체적인 목표는 고상 펩타이드 합성(solid phase peptide synthesis)과 펩타이드의 수성 자기 조립을 통해 고도로 정렬된 나노 시트를 형성하는 간단하고 효율적인 방법을 설명하는 것입니다. 폴리펩타이드와 구조적으로 유사한 펩타이드는 곁사슬이 알파 탄소가 아닌 질소에 결합된 치환된 글리신 폴리머입니다. 이 과정은 다른 서브 모노머 방법을 통해 특정 펩타이드 서열을 합성하는 것으로 시작됩니다.

서브 모노머 방법은 각 모노머를 체인에 순차적으로 도입하는 두 가지 간단한 화학적 단계로 구성됩니다. 첫째, 고체 지지체에 결합된 아민을 브로모아세틸화합니다. 둘째, 브롬화물을 일차 아민으로 치환합니다.

원하는 사슬 길이가 달성될 때까지 이러한 단계를 반복합니다. 사슬 연장 후, 펩타이드를 고체 지지체로부터 절단하고, 생성된 조 펩타이드 오일을 HPLC로 정제 및 분석하여 펩타이드가 나노 시트로 자가 조립되도록 유도합니다. 유리 바이알에 펩타이드의 희석된 수성 완충 용액을 준비하고 부드럽게 혼합합니다. 마지막 단계로.

나노 시트를 현미경으로 관찰합니다. 그 결과, 두 가지 간단한 화학적 단계의 반복 주기를 통해 나노 시트로 자발적으로 자기 조립되는 서열 특이적 폴리머를 생성할 수 있음을 보여줍니다. 펩타이드는 단백질과 전통적인 폴리머의 중간적 성질을 가진 생체 모방 폴리머의 새로운 부류입니다.

펩타이드는 전통적인 폴리머와 같이 견고하고 합성 범용성이 높으면서도, 단백질 및 DNA처럼 매우 정밀한 조절이 가능하고 서열 특이적이라는 특징이 있습니다. 이에 따라 펩타이드는 생체 활성 약물의 식별이나 인공 단백질 설계와 같은 생의학 및 재료 과학의 핵심 문제를 해결하기 위한 첨단 소재로 부상하고 있습니다. 펩타이드의 주요 장점으로는 정밀한 서열 제어, 매우 다양한 빌딩 블록의 가용성, 효율적인 합성과 프로테아제 안정성을 꼽을 수 있습니다. 본 가이드에서는 기본적인 장비와 시판 시약을 이용한 일반적인 펩타이드 수동 합성법을 설명하여, 대부분의 연구실에서 펩타이드를 쉽게 합성할 수 있도록 합니다.

합성 단계의 시각적 시연은 매우 중요하며 고상 합성 분야에 입문하는 연구자들에게 귀중한 참고 자료가 됩니다. 본 영상에서는 양친매성 36-mer 펩타이드의 정제 및 분석법과 더불어, 고도로 정렬된 나노 시트로의 자기 조립 과정을 최초로 설명합니다. 서면 프로토콜에 기술된 대로 실험 장치를 설정하는 것부터 이 프로토콜을 시작하십시오.

명확한 시각적 확인을 위해, 다음 단계들은 일회용 폴리프로필렌 프리트 카트리지 대신 유리 반응 용기에서 수행됩니다. 100 mg의 R amide resin을 프리트 반응 용기에 세팅한 후, 2 mL의 dimethyl form amide 또는 DMF를 첨가하여 resin을 팽윤시키고 10분 동안 버블링하여 교반합니다. 그 다음, 진공으로 용액을 배출하여 팽윤된 resin을 분리합니다.

다음으로, FM O 그룹을 탈보호하기 위해 DMF에 희석된 20% full methyl pyridine 1 mL를 첨가합니다. 2분 동안 교반한 후 배출합니다. 이 과정을 12분 동안 반복한 다음, DMF 2 mL를 첨가하여 15초 동안 교반하고 배출함으로써 레진을 세척합니다.

브로모 아세틸화 및 치환 단계를 포함하는 첫 번째 서브 모노머 사이클로 펩타이드 사슬 성장을 시작합니다. 브로모 아세틸화를 위해 0.6 molar 브로모 아세트산이 포함된 DMF 1 mL와 디이소프로필카보마이드 86 µL를 첨가합니다. 30분 동안 교반한 후, 배출하고 2 mL의 DMF로 헹굽니다.

다음으로, end methyl pyro genone에 1~2 M 아민 1 mL를 첨가하여 치환을 수행하고 30~120분 동안 배양합니다. 배양 후, 액체를 따라내고 2 mL의 DMF로 헹굽니다. 다시 서브 모노머 사이클을 반복하여 펩타이드 체인을 계속 성장시킵니다. 마지막 치환이 완료되면 2 mL의 DMF로 헹굽니다.

그 후 diora 메탄 세척 캡을 씌우고 절단 단계 전까지 반응 용기를 보관하십시오. 절단을 시작하려면, 후드 내에서 적절한 개인 보호 장구를 착용한 상태로 건조된 레진 전체를 20 milliliter 신틸레이션 유리 바이알로 옮기십시오. 신틸레이션 유리 바이알에 4 milliliter의 트리플루오로아세트산(tri fluoro acetic acid) 또는 TFA 절단 칵테일을 넣고 캡을 닫으십시오. 실온에서 10분에서 2시간 동안 강하게 교반하십시오.

또는 회전 쉐이커를 사용하여 용액을 혼합합니다. 일회용 폴리프로필렌 프리티드 카트리지를 통해 레진을 여과하여 미리 무게를 잰 새로운 20 milliliter 섬광 유리 바이알에 TFA 절단 용액을 수집합니다. 다음으로, 1 milliliter의 신선한 절단 칵테일을 추가하여 레진을 세척하고 잔류 펩타이드를 수집합니다.

이 과정을 반복하고, 두 번 헹굽니다. 부드러운 질소 기류를 불어넣거나 Biot charge V 10 증발기를 사용하여 TFA를 증발시킵니다. 조유(crude oil)를 1:1 비율의 아세토니트릴과 물 혼합액 6 mL에 녹입니다.

그런 다음 시료를 동결 및 동결건조합니다. 이 과정은 두 번째 동결건조 후에 한 번 더 반복해야 합니다. 조생성물의 무게를 기록하고, 분석용 HPLC 및/또는 전기분무 LCMS 조합을 통해 확인한 후 -20 °C에서 건조 분말 상태로 보관하십시오.

조물질의 순도와 원하는 분자량이 존재하는지 여부는 본문에 설명된 절차를 따라 결정할 수 있습니다. 이후 조 peptide 혼합물은 서술된 절차에 따라 역상 prep HPLC로 정제할 수 있습니다. 이 섹션에서는 단일 사슬 서열 특이적 양친물성 36 me peptide로부터 시트를 형성하는 프로토콜을 설명합니다.

펩타이드 가닥을 합성, 정제 및 동결 건조한 후, 생성된 흰색 분말을 DMSO에 용해하여 2 mM 스톡 용액을 제조합니다. 다음으로, 20 µM 펩타이드 용액을 준비하기 위해 Dr.Glass 파일 하나를 준비합니다. 먼저, milli Q water 445 µL와 10 x sheet formation buffer 50 µL를 첨가합니다.

바이알을 볼텍싱하여 혼합합니다. 그런 다음 2 mM 펩타이드 스톡 용액 5 µL를 첨가하고 부드럽게 팽창시킵니다. 이렇게 생성된 용액 시트는 희석된 수성 펩타이드 용액을 부드럽게 교반함으로써 형성됩니다.

뚜껑이 닫힌 유리 바이알을 수평 상태에서 수직 상태로 천천히 기울입니다. 이 방법으로도 시트가 생성되지만, 부드럽게 흔드는 방식에 비해 시트의 크기가 더 작고 직선 가장자리가 적은 경향이 있어 고품질 시트를 얻기에는 부족할 수 있습니다.

나노 시트의 형광 염색을 위해 튜브 회전기나 맞춤형 로커를 사용하여 유리 바이알을 수평축을 중심으로 하루 동안 천천히 회전시킵니다. 나노 시트 용액 100 µL에 100 µM Nile red 1 µL를 첨가하여 Nile red의 최종 농도가 1 µM이 되도록 합니다. Nile red는 환경 민감성 염료로, 소수성 환경에 위치할 때 형광 강도가 증가합니다. 다음으로, 뜨거운 물에 1% agarose 용액을 만들어 플라스틱 페트리 접시에 붓습니다.

aros 용액의 두께가 약 1/8인치가 되도록 하고, 평평한 표면에서 용액이 흐트러지지 않은 상태로 식도록 둡니다. aros가 굳으면 스패튤라를 사용하여 1cm x 1cm 크기의 정사각형으로 자릅니다. 그런 다음 자른 정사각형 조각들을 유리 슬라이드로 옮겨 동일한 평면에 모으고, aros 조각 위에 sheet 용액 1µL를 점적합니다.

2분 후, aros가 완충액을 흡수하여 시트가 표면에 남아야 합니다. 15분 이내에 시트를 이미지화하십시오. 또는, 시트와 용액을 이미지화하려면 유리 슬라이드 위의 직경 20 millimeter, 두께 0.12 millimeter 가스켓 내부에 15 microliters를 로딩하십시오.

샘플을 커버슬립으로 덮고 며칠 이내에 이미징하여 나노 시트의 SEM 분석을 수행합니다. 먼저 나노 시트의 흡착을 돕기 위해 실리콘 칩을 플라스마 식각합니다. 그다음 플라스마 처리된 실리콘 기판 위에 펩타이드 시트 용액 20 µL를 떨어뜨리고 3분 동안 그대로 둡니다. 이후 킴와이프(Kim wipe) 끝을 사용하여 과잉 용액을 제거하고, 표면에 20 µL의 물을 떨어뜨린 후 다시 과잉 용액을 흡수시켜 버퍼와 염을 제거합니다.

또는, 완충액과 염을 제거하기 위해 펩타이드 시트 용액을 증류수로 투석합니다. 이 경우, 투석된 시트 용액 20 µL를 플라스마 처리된 실리콘 기판 위에 떨어뜨리고 자연 건조시킵니다. 플라스마 처리된 실리콘 기판 위에서 시트 용액이 건조되면, 1 kV에서 5 kV 사이의 빔 에너지를 사용하는 인렌즈 검출기(in lens detector)가 장착된 SEM으로 시트를 이미지화할 수 있습니다.

고도로 정렬된 2차원 나노 시트로 접히는 서열 특이적 36 me 블록 전하 펩타이드의 합성과 특성 분석 및 정제가 수행되었습니다. 36 me 블록 전하 펩타이드 합성에 사용된 아민은 ethylene diamine, phenethyl amine 및 t butyl beta alanine입니다. 합성 후, 조펩타이드는 95% 수성 TFA를 사용하여 수지로부터 분리되었습니다.

TFA 용액을 수집하여 증발시킨 후, 조제된 36 me 블록 전하 펩타이드를 역상 HPLC로 정제하였습니다. 정제된 블록 전하 펩타이드의 질량은 MALDI로 확인하였습니다.

관찰된 질량 4981.2는 계산된 질량 4981.74와 밀접하게 일치합니다. 동결건조 분말을 DMSO에 녹여 2 mM 스탁 용액을 제조하고 4 °C에서 보관하였습니다. 앞서 설명한 프로토콜에 따라 시트를 준비하고 형광 광학 현미경으로 이미지를 촬영하였습니다.

특징 크기가 최대 300 µm에 이르는 다양한 형태가 관찰되었으며, 특히 직선형 모서리가 두드러지게 나타납니다. SEM을 사용하여 시트를 촬영한 결과에서도 마찬가지로 뚜렷한 직선형 모서리가 확인되었습니다. 본 영상에서는 펩타이드의 고상 합성 및 펩타이드의 수성 자기 조립을 통한 나노 시트 제조를 위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 설명합니다.

수백 가지의 am 평균 빌딩 블록을 쉽게 구할 수 있고 본 프로토콜에 사용할 수 있으므로, 폴리펩타이드로 접근 가능한 설계 공간은 사실상 무한합니다. 펩타이드는 합성 유연성, 견고성 및 정렬 특성 덕분에 생의학 및 나노과학 연구에서 유망한 재료입니다. 특히 원자 수준에서 나노 시트는 2차원 디스플레이 스캐폴드, 막 모방체, 바이오 센서, 단백질 모방체 및 소자 제작을 위한 잠재적 플랫폼 역할을 합니다.

trior, 아세트산 및 브로모아세트산과 같은 부식성 시약을 다루는 것은 매우 위험하므로, 부상을 방지하기 위해 모든 반응은 흄 후드 내에서 수행하고 적절한 개인 보호 장구를 착용하십시오.