Nanoprecipitation 기법을 통해 디블록 고분자 Nanoparticles의 제형

이 절차의 전체적인 목적은 나노 침전법을 사용하여 고분자 나노입자를 합성하는 것입니다. 이는 먼저 E-D-C-N-H-S 반응을 수행하여 A-P-L-G-A PEG 공중합체를 생성함으로써 이루어집니다. 이후 PLGA PEG 공중합체를 사용하여 나노 침전을 통해 관심 약물 또는 화물을 캡슐화한 나노입자를 생성합니다.

이 단계에서 동적 광산란법(dynamic light scattering), 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy) 또는 HPLC를 통해 크기, 표면 전하 및 약물 적재 효율을 포함한 기본적인 생물물리학적 특성 분석을 수행할 수 있습니다. 나노입자가 난용성 항암 치료제를 전달할 수 있어 기존 치료법보다 더 효과적일 수 있으므로, 이 기술의 함의는 종양 치료로 확장됩니다. 이러한 방법은 암 치료에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

또한 세포 내 수송과 같은 다른 시스템을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 나노입자는 표적 리간드와 접합될 수 있으며, 이 기술을 입증하는 영상제를 사용하여 체내(in vivo) 또는 체외(in vitro)에서 시각화할 수 있습니다. 오늘은 저희 실험실의 기술자인 Rohit Sukumar와 Natalie Cummings가 함께하겠습니다. PLGA PEG 공중합체의 합성을 시작하려면, carboxylate PLGA를 아세토니트릴(Acetonitrile)에 5 mM 농도로 녹이고 부드럽게 교반하십시오.

그 다음, PLGA 대비 5배의 화학양론적 과량을 제공하여 25 millimolar 농도가 되도록 충분한 양의 NHS와 EDC를 첨가합니다. PLGA 카르복실기가 PGA NHS로 전환될 수 있도록 용액을 약 1시간 동안 부드럽게 교반합니다. 1시간 후, 용액 부피의 약 10배에 해당하는 과량의 세척액인 메탄올을 첨가하여 PGA NHS 반응 생성물을 침전시킵니다. 용액을 2000 ×g에서 원심분리하여 P-L-G-A-N-H-S 펠렛을 형성합니다. 원심분리 후, EDC와 NHS의 흔적을 제거하기 위해 상층액을 버립니다. 메탄올을 이용한 이 세척 과정을 최소 3회 반복합니다.

세척이 완료된 후, 세척액의 잔해를 제거하기 위해 P-L-G-A-N-H-S를 진공 상태에서 30분 동안 건조합니다. 이제 P-L-G-A-N-H-S 펠릿을 PLGA를 용해할 때 처음에 사용했던 것과 동일한 농도의 aceto NI trial에 다시 용해합니다.

용해가 완료되면, PLGA 용액에 이종 작용성 PEG를 첨가하십시오. 이때 5 mM 농도로 첨가합니다.

혼합 용액을 24시간 동안 지속적으로 교반하며 반응시킵니다. 메탄올을 과량 첨가하여 PLGA PEG 블록 공중합체 반응 생성물을 침전시킵니다. 반응하지 않은 잔류 PEG를 모두 제거하기 위해 세척 및 원심분리 과정을 추가로 3회 더 반복합니다.

합성의 마지막 단계로, 진공 상태에서 PLGA PEG 블록 공중합체를 건조합니다. 나노입자 침전은 PLGA PEG 블록 공중합체와 캡슐화할 약물을 A-P-L-G-A 용매에 용해하는 것으로 시작됩니다. 용매의 선택은 나노입자의 특성에 영향을 미치므로 매우 중요합니다. 그 다음, 최종 중합체 농도가 약 3 mg/mL가 되도록, 교반 중인 물 3~10배 부피에 중합체-약물 혼합물을 한 방울씩 첨가합니다.

유기 용액을 수성 상에 첨가하는 과정은 적절한 크기의 나노입자를 형성하는 데 매우 중요합니다. 나노입자가 자기 조립을 통해 형성되고 유기 용매의 흔적이 제거될 수 있도록 감압 상태에서 2시간 동안 교반을 계속합니다. 2시간의 교반 후,

Amon 필터를 사용하여 2,700 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 나노입자를 농축합니다. 그 후, 포집되지 않은 약물을 제거하기 위해 PBS로 나노입자를 세척하고 다시 원심분리합니다. 마지막으로, 나노입자를 PBS에 재현탁합니다.

나노입자의 특성을 더 잘 이해하기 위해 크기, 표면 전하 및 약물 적재 효율을 포함한 기본적인 생물물리학적 특성 분석을 수행할 수 있습니다. 나노입자는 서면 프로토콜에 설명된 대로 보관할 수 있으며, PLGA PEG 나노입자를 특성화하기 위해 투과 전자 현미경을 사용하여 나노입자의 크기, 분포 및 구조를 확인하였습니다. 입자 크기는 일반적으로 나노미터 범위입니다.

불균일한 크기 분포를 가진 큰 입자 크기는 접합 반응의 오류이거나 나노 침전법의 최적화가 필요함을 나타낼 수 있습니다. 여기에는 표준 HPLC를 통해 Paclitaxel의 적재 효율과 방출을 정량화한 약물 방출 역학 연구가 제시되어 있습니다. 알려진 일정량의 나노입자를 정해진 시간 간격으로 투석하였습니다.

투석 장치 내부의 내용물을 수집하고, 나노입자를 용해시키기 위해 동일한 부피의 유기 용매를 첨가하였습니다. 그 후, 이 시료들에 대해 HPLC를 수행하였습니다. Paclitaxel 함량을 정량화하기 위해, 숙련된 경우 이 나노 침전 기술은 3시간 이내에 적절히 수행될 수 있습니다.

이 기술을 수행할 때는 입자 생성 후 커다란 입자가 형성되는 것을 방지하기 위해 항상 유기상을 수용상에 천천히 첨가해야 함을 기억하십시오. 이 기술은 나노의학 분야의 암 연구자들이 과거에는 이 절차를 거친 암 환자에게 너무 독성이 강하다고 여겨졌던 난용성 약물의 사용 가능성을 탐색할 수 있는 길을 열어주었습니다. 난용성 약물이 전신 독성 문제가 해결되었을 때 효과적인지, 또는 표적 리간드가 나노입자를 목적지까지 적절하게 유도하는지와 같은 의문점을 해결하기 위해 in vivo 효능 연구나 영상 연구와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.