효소 아세테이트 키나제의 아세테이트 - 형성 활동의 직접적인 탐지

본 실험은 아세테이트 키나아제의 아세테이트 형성 활성을 직접 측정하는 것을 목적으로 합니다. 아세틸 포스페이트와 DP 기질이 포함된 반응 혼합물에 효소를 첨가하여 반응을 개시합니다. 그런 다음 하이드록실아민 염화물을 첨가하여 남아 있는 아세틸 포스페이트를 아세틸 하이드록실레이트로 전환합니다.

아세틸 하이드록실레이트를 측정 가능한 색상의 제이철 하이드록실레이트 복합체로 전환하기 위해 발색액을 첨가합니다. 반응 중에 소비된 아세틸 인산 기질의 양을 기반으로 분광 광도법을 통해 효소 반응 속도 매개변수를 결정할 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 장점은 ATP 생성을 ADP 환원으로 결합시키는 방식이 아니라, 아세틸 인산의 소비를 직접 측정한다는 점에 있습니다. 이 분석법은 ATP 생성에 의존하지 않으므로, ATP 대신 무기 인산을 생성하는 새로운 아세테이트 키나아제 그룹에도 적용할 수 있습니다. 6~8개 지점의 표준 곡선을 작성하려면, 아세틸 인산 스톡 용액을 100 mM Tris로 희석하여 최종 시료 부피를 300 µL로 맞춥니다. 또한 아세틸 인산이 포함되지 않은 대조군 시료를 포함시키고, 모든 시료를 37 °C 히팅 블록에서 1분 동안 평형화합니다.

이제 2 M 하이드록실아민 염산염 50 µL를 넣고, 세 번 흔들어 섞은 후 60 °C 가열 블록에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 발색 용액 100 µL를 넣고 세 번 흔들어 섞은 뒤, 상온에서 최소 1분 동안 색이 발색되도록 둡니다. 분광광도계용 플라스틱 큐벳을 사용하여 샘플을 원심분리합니다.

540 nanometers에서 시료를 측정하십시오. 적절한 데이터 분석 및 그래프 작성 소프트웨어를 사용하여 540 nanometers에서의 흡광도와 acetyl phosphate의 micromoles 간의 표준 곡선을 생성하십시오. r 제곱 값을 계산하십시오.

반응 혼합물을 300 µL씩 마이크로 원심분리 튜브에 분배합니다. 효소를 넣지 않은 대조군 반응을 반드시 포함하십시오. 튜브를 37 °C에서 1분 동안 평형화합니다. 여러 반응을 수행하는 경우, 특정 시간 간격으로 튜브에 효소를 첨가하고 각 튜브를 즉시 37 °C 가열 블록으로 되돌려 놓습니다.

5분 후, 2 M 하이드록실아민 염산염 50 µL를 첨가하고 혼합한 뒤 60 °C에서 5분 동안 배양합니다. 그다음 현색액 100 µL를 첨가하고 혼합하여 실온에서 발색시킵니다. 그 후 샘플을 18,000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다.

540 nanometers에서 흡광도를 측정합니다. acetyl phosphate 표준 곡선과 비교하여 존재하는 acetyl phosphate의 양을 결정합니다. 데이터는 플롯을 그리고 McKayla Cementin 방정식에 맞추어 반응 속도론적 파라미터를 결정할 수 있습니다.

본 분석법은 acetyl phosphate 기질의 소비량을 측정하여 아세테이트 형성 방향의 acetate kinase 활성을 결정합니다. 효소 반응 중 일정 시간이 지난 후 남아있는 acetyl phosphate는 acetyl oxybate로 전환된 후 ferric hydroxy acetate 복합체로 변하며, 이는 540 nanometers에서 측정 가능한 붉은색을 띱니다. 540 nanometers에서의 흡광도를 micromoles acetyl phosphate에 대해 도식화한 이 전형적인 표준 곡선의 기울기는 acetyl phosphate 1 micromole당 1.2332 흡광도 단위입니다.

결과로 얻은 r squared 값이 0.99라는 것은 데이터가 여기에 묘사된 선형 방정식과 잘 일치함을 나타냅니다. 이 분석법은 다양한 효소 제제에 대한 acetyl phosphate의 KM을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 5 millimolar의 DP 조건에서 acetyl phosphate 농도를 달리하여 정제된 메탄올 Sarina thermophilic 유래 재조합 acetate kinase를 분석한 결과, 각 기질에 대해 표준 McKayla cementin 유사 kinetics를 따랐으며, 그 결과 acetyl phosphate의 겉보기 KM 값은 0.27 ± 0.01 millimolar로 나타났습니다.

표준 결합 분석법과 달리, 이 직접 분석법은 TP 이외의 기질을 사용하는 아세테이트 키나아제(acetate kinase)의 활성을 측정할 수 있습니다. 예를 들어, 피로인산-생성형 inba histolytica 아세테이트 키나아제에 의해 아세틸 인산(acetyl phosphate)이 이용되는 경우, 반응 혼합물에서 DP 대신 인산나트륨(sodium phosphate)이 사용되었습니다. 결과 곡선은 아세틸 인산의 겉보기 KM 값이 0.50 ± 0.006 millimolar임을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후, 소비된 아세틸 인산의 양을 결정하여 아세테이트 키나아제의 활성을 직접 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

재현 가능한 결과를 얻기 위한 핵심 요소는 각 단계, 특히 효소 첨가 및 혼합 단계에서 일관성을 유지하는 것입니다.