Photoacoustic Flowmetry를 사용하여 순환 흑색증 전지의 탐지 및 격리

다음 실험의 목적은 이차 종양이 형성되기 전에 암의 존재를 검출하는 것입니다. 이는 먼저 4기 흑색종 환자로부터 혈액 샘플을 채취하고 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 혈액을 광음향 유동 챔버에 주입하여 흑색종 세포를 검출하고 분리합니다.

다음으로, 포획된 세포를 이미징하여 검출된 흑색종의 존재를 확인합니다. 결과는 광음향 파형 및 세포 이미징 기술을 기반으로 흑색종 세포를 정확하고 신속하게 검출하고 분리하는 시스템의 능력을 보여줍니다. R-T-P-C-R, biomes Magnetic Cell Sorting 및 기타 방법과 같은 기존의 순환 흑색종 세포 검출 방법과 비교하여 본 기술의 주요 장점은 라벨 프리 방식이라는 점이며, 이를 통해 세포 표면을 변경하거나 기판에 고정하지 않고도 순환 흑색종 세포를 포획할 수 있다는 것입니다.

전이성 암 검출을 위한 시료를 준비하려면 먼저 4기 암 환자로부터 전혈 약 10 milliliters를 채취하십시오. 5 milliliter vacutainer 튜브 두 개에 나누어 담은 후, 3000 RPM에서 10분 동안 원심분리합니다. 그러면 혈액 시료가 세 개의 서로 다른 층으로 분리됩니다. 가장 아래층은 적혈구로 구성됩니다.

버피 코트(buffy coat)라고도 불리는 중간층에는 백혈구와 흑색종 세포가 포함되어 있으며, 상층에는 혈장과 혈소판이 포함되어 있습니다. 버피 코트를 건드리지 않고 가능한 한 많은 양의 혈장을 제거하십시오. 2 mL 마이크로 튜브에 250 µL의 his opaque 10 77을 추가하십시오.

9인치 파스퇴르 피펫을 사용하여 남은 혈장, 버피 코트(Buffy coat) 전체, 그리고 적혈구의 최상층을 추출합니다. 이때 500 µL 미만으로 수집되도록 주의하십시오. 추출한 용액을 이전에 준비한 윈트로브(wind Trobe) 튜브로 옮깁니다.

혈액이 다시 분리되지만, 이번에는 히스파(hispa)에 의해 적혈구가 분리되어 버피코트(Buffy coat)를 쉽게 추출할 수 있습니다. 9인치 페사(Pesa) 피펫을 사용하여 버피코트 전체를 분리하고 2 mL 엔드 오프(eend orph) 튜브에 넣으십시오. 그런 다음 2% v/v 베타20(between 20)이 포함된 1.5 mL PBS에 현탁하십시오.

플로우 챔버를 제작하려면, 길이 8 mm, 외경 20 mm, 내경 17 mm의 아크릴 실린더를 준비합니다. 다음으로 실린더 측면에 서로 90도 각도가 되도록 직경 5 mm의 구멍 세 개를 뚫습니다. 그런 다음 폴리머 튜브 세 조각을 잘라 뚫린 구멍에 삽입합니다.

아크릴 링 바닥에 파라필름을 팽팽하게 늘려 붙여 수밀 씰을 만듭니다. 파라필름은 아크릴 링과 함께 얕은 그릇 형태를 이루며, 유동 챔버를 형성할 아크릴아마이드 용액을 담게 됩니다. 서로 마주 보는 튜브 조각들을 통해 직경 1.6 millimeter 와이어를 걸치는데, 이때 링 중앙을 통해 세 번째 튜브 속으로 와이어만 보이도록 배치하십시오.

직경 1.6 millimeter 와이어를 삽입하고, 튜브를 매달린 와이어로부터 1 millimeter 떨어진 곳에 위치시킵니다. 이 와이어들은 acrylamide가 튜빙 내부로 들어가는 것을 방지합니다. 5 milliliters의 acrylamide를 준비합니다.

그런 다음 혼합물을 아크릴 링에 빠르게 부어 상단까지 채웁니다. 몇 초 후면 용액이 겔화됩니다. 유동 챔버 몰드를 만들기 위해 아크릴아마이드 겔을 건드리지 않도록 주의하며 와이어를 조심스럽게 뽑아내면, 원통형 유로와 유로에 초점을 맞춘 광섬유를 배치할 공간이 형성됩니다.

이제 유동 챔버를 초음파 젤을 사용하여 음향적으로 사용할 준비가 되었습니다. 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride) 압전 음향 트랜스듀서를 유동 경로 바로 위의 유동 챔버에 결합하십시오. 바요넷 커넥터 또는 BNC 케이블을 사용하여 트랜스듀서를 광대역 수신기의 입력단에 연결하십시오.

필터의 출력을 오실로스코프에 연결하여 오실로스코프를 트리거합니다. 트랜스듀서 근처에 포토다이오드를 설치하고 B NNC 케이블을 사용하여 오실로스코프에 연결합니다. 작은 공기 주머니가 형성될 때까지 유동 챔버의 작은 튜브를 뽑아낸 후 트랜스듀서와 결합합니다.

그 다음 광섬유를 삽입하고 포켓을 물로 채워 인터페이스 신호를 줄이고 유로에 조사되는 레이저 광량을 늘립니다. 광섬유의 수치 구경과 유로까지의 짧은 거리 덕분에, 레이저는 어느 시점에서나 한 번에 하나의 샘플 슬러그만을 조사하게 되며, 이를 통해 레이저 바로 앞에 있는 샘플이 광음향 신호를 생성하는 샘플과 동일함을 보장합니다.

다음으로, T 커넥터를 유동 챔버의 한쪽 암에 연결하고, 커넥터의 다른 가지들에 두 개의 시린지 펌프를 연결합니다. 하나의 시린지에는 공기를, 다른 시린지에는 앞서 준비한 세포 현탁액을 넣습니다. 그런 다음 두 시린지 펌프를 모두 작동시킵니다.

두 가지 허용 가능한 유체가 T-접합부에 도달하면, 이들은 균질한 슬러그 형태로 분할되어 트랜스듀서를 지나 흐르게 됩니다. 흐르는 시료에 나노초 펄스 레이저를 조사하여 흑색종 세포 내에서 광음향파를 생성하십시오. 멜라닌은 광대역 광흡수체이므로, 가시광선 영역의 모든 레이저 파장을 사용할 수 있습니다.

슬러그가 트랜스듀서 위에 있을 때 오실로스코프에 신호가 나타나면 해당 슬러그에 흑색종이 포함되어 있음을 나타냅니다. 슬러그를 수집 바이알에 떨어뜨리기 전에 시스템을 통해 추적하십시오. 면역세포화학 분석을 위한 시료를 준비하려면, 글라스 슬라이드를 사이토 퍼널에 넣고 사이토스핀에 장착하여 원심분리함으로써 포집된 세포가 글라스 슬라이드에 잘 부착되도록 하십시오.

각 깔때기에 1% BSA/PBS 용액 100 µL를 넣습니다. 그런 다음 600 RPM에서 3분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 CyTOF 깔때기에 세포 시료를 첨가한 후, 600 RPM에서 3분 동안 다시 원심분리합니다.

에탄올 기반 고정액을 슬라이드에 분사합니다. 그런 다음 비특이적 결합을 차단하기 위해 PBS로 10분씩 2회 세척합니다. 각 슬라이드를 goat serum 10 µL와 PBS 90 µL의 혼합액과 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

배양 후, 슬라이드의 액체를 따라내고 1차 항체 용액을 첨가합니다. 각 슬라이드에는 PBS에 희석한 1% rabbit mark, 1% mouse CD 45 및 10% goat serum이 포함되어야 하며, 습윤 챔버 내의 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, PBS로 슬라이드를 10분 동안 세 번 세척합니다.

그런 다음 슬라이드를 적절한 형광 2차 항체에 넣고 상온의 암소에서 1시간 동안 배양한 후, 슬라이드의 용액을 따라냅니다. 이어서 PBS로 5분씩 세 번 세척하고, 핵을 염색하기 위해 세포를 0.1 µg/mL의 DPI와 함께 1분 동안 배양합니다. 그런 다음 슬라이드의 용액을 따라내고 PBS로 세척합니다.

마지막으로, 수지 기반의 봉입제를 사용하여 세포 샘플 위에 커버 슬립을 덮고 투명 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉한 후 형광 현미경으로 촬영합니다. 백혈구와 흑색종 세포에서 생성된 광음향 파형이 여기 왼쪽에 표시되어 있습니다. 고유한 색소가 없는 백혈구는 광음향 파형을 생성하지 않으며, 오른쪽과 같이 전자 노이즈의 평탄한 선으로 나타납니다.

하지만, 색소가 있는 멜라노마 세포는 강력한 광음향파를 생성합니다. 면역세포화학 염색 및 화학 염색 후, 배양된 멜라노마 세포는 청색의 점상 신호를 나타내며, 그중 하나는 DPI 이미지 위에 녹색으로 강조 표시되었고, 다른 하나는 백혈구 지표인 CD 45로 표시되었습니다. 이 그림은 발달 후 여러 백혈구 사이에 있는 멜라노마 세포를 보여줍니다.

본 기술은 암 진단 분야의 연구자들이 전이 현상을 탐구하여 암 진단 능력을 향상시키고, 궁극적으로 암의 치명적인 확산을 치료할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.