중단 - 흐름 분광 광도법을 사용하여 플라빈 종속 Monooxygenase의 Reductive 및 산화 반쪽 반응을 모니터링

이 절차에서는 stopped flow 장비를 사용하여 SID A의 서로 다른 스펙트럼 형태를 검출하고 반응 속도를 측정합니다. SID A에 의해 촉매되는 반응은 FAD의 환원 및 산화 반쪽 반응으로 나눌 수 있습니다. 산화된 flavin은 N-A-D-P-H와 결합하여 환원된 flavin과 NADP를 형성하며, 분자 산소와의 반응 및 ornithine의 결합은 C four의 형성으로 이어집니다.

오르니틴의 수산화 이후 생성된 하이드록시 플라빈은 탈수되어 산화된 효소를 형성합니다. NA DP plus는 촉매 주기 전반에 걸쳐 결합된 상태를 유지하며, 가장 마지막에 방출되는 기질입니다. stopped flow 장치는 적은 양의 반응물을 빠르게 혼합하고 기록하는 것을 용이하게 합니다.

시간에 따른 스펙트럼 변화를 측정하는 분광광도계는 효소 촉매 반응, 특히 일시적 중간체의 생성 및 소실 속도를 측정할 수 있게 해줍니다. 저희 연구실의 구성원인 Rita Robinson과 Enviro Romero가 flavin monooxygenase를 모델 시스템으로 하여 세트 A를 이용해 이 실험들을 시연하겠습니다. 마그네틱 바가 들어 있는 500 mL 뷰흐너 플라스크에 100 mM 인산칼륨 완충액 250 mL를 붓습니다.

플라스크를 고무 마개로 밀봉한 후, 교반판 위에 놓고 플라스크의 짧은 튜브를 슐렝크 라인(schlenk line)에 연결합니다. 상온에서 교반하며 진공 상태로 한 시간 동안 버퍼의 가스를 제거한 다음, 아르곤으로 퍼징합니다. 이 과정을 5회 반복합니다.

마지막으로 플라스크를 Argon으로 10초 동안 퍼지합니다. 진공 매니폴드에서 플라스크를 분리하여 글로브 박스 내부에 넣습니다. 플라스크를 연 상태로 계속해서 격렬하게 교반합니다.

저장조 시린지를 18.13 units per milliliter glucose oxidase와 100 millimolar glucose 용액으로 채웁니다. 이제 구동 밸브를 로드 위치로 설정하십시오. 구동 시린지를 채웁니다.

다음으로 F 밸브를 드라이브 위치로 돌립니다. pro data 제어 소프트웨어를 사용하여 stop syringe 비우기를 클릭한 다음, 해당 드라이브 램을 수동으로 올려 드라이브 시린지 F의 버퍼를 유로 회로로 밀어냅니다. 나머지 세 개의 드라이브 시린지에도 동일하게 수행하고 1시간 동안 평형화합니다.

이제 리저버 시린지를 다시 채우고 정지된 유동 시스템의 플러싱을 반복합니다. 산소 포화 완충액을 준비하려면, 용액을 100% oxygen으로 한 시간 동안 교반하며 버블링합니다.

그 다음 바이알에서 짧은 바늘을 제거하고 10초 동안 기다립니다. 이어서 긴 바늘을 제거하고 닫힌 바이알을 글로브 박스에 넣습니다. N-A-D-P-H 용액의 경우입니다.

1 mg의 NADPH가 들어 있는 1.5 mL 에펜도르프 튜브를 글로브 박스에 넣습니다. pH 7.5의 혐기성 100 mM 인산칼륨 완충액 300 µL에 용해시킵니다.

N-A-D-P-H 농도를 결정하기 위해 30 µL를 제거합니다. 이제 효소 스톡에서 산소를 제거하기 위해, 용액을 교반 바 캡과 마개 및 알루미늄 씰이 포함된 25 mL 바이알로 옮깁니다. 얼음 위에 둡니다.

Schlenk 라인에 연결한 후 20분 동안 진공 탈기를 수행하고, 이어서 argon으로 퍼지합니다. 마지막으로 바이알을 argon으로 10초 동안 퍼지한 다음 진공 매니폴드에서 분리합니다. 바이알을 글로브 박스 내의 얼음 위에 둡니다.

pro data 제어 소프트웨어의 제어 패널 창에서 포토다이오드 어레이(photo diode array), 외부 트리거(external trigger) 및 로그 스케일(logarithmic scale)을 선택하십시오. 또한 pro data 뷰어 소프트웨어를 실행하여 데이터 파일 저장 디렉터리를 지정하십시오.

이제 저장조 시린지 C와 F의 용액을 혐기성 100 millimolar 인산칼륨 완충액 pH 7.5로 교체하십시오. C와 F 밸브를 구동 위치로 돌리십시오. pro data 제어 소프트웨어에서 stop 시린지 비우기를 클릭하십시오.

그런 다음, 해당 구동 램(drive ram)을 수동으로 들어 올려 두 구동 주입기에서 버퍼를 유로 회로로 밀어 넣습니다. 저장 주입기 C와 F를 사용하여 세척 과정을 세 번 더 반복합니다. 유로 회로에서 glucose oxidase가 완전히 제거되었는지 확인하려면, pro data 제어 소프트웨어에서 baseline을 클릭하십시오.

리저버 시린지 F의 용액을 효소 용액으로 교체하십시오. F 밸브를 구동 위치로 돌리십시오. pro data 제어 소프트웨어에서 stop 시린지 비우기(empty the stop syringe)를 클릭하십시오.

해당 드라이브 램을 수동으로 올려 드라이브 시린지 F의 효소 용액을 유로 회로로 밀어 넣습니다. 프로 데이터 제어 소프트웨어로 돌아가 획득 시간을 60초로 설정합니다. 두 드라이브 시린지에 각각의 용액이 채워져 있는지, 그리고 드라이브 램이 드라이브 시린지 피스톤에 접촉해 있는지 확인합니다.

두 밸브를 모두 구동 위치로 돌리고, pro data 제어 소프트웨어에서 acquire를 클릭하여 구동을 수행합니다. 구동을 통해 얻은 452 nanometer 흡광도 값을 사용하여 산화 형태 효소의 스펙트럼 데이터를 3회 반복 측정합니다. 혼합 전의 효소 농도를 결정하고 4 milliliters의 N-A-D-P-H 용액을 준비합니다.

N-A-D-P-H 용액을 사용하여 충전 저장조 주사기 C를 1.5배 더 농축하여 채우고, 앞서 설명한 대로 정지 주사기를 세 번 비우고 다시 채우십시오. 이제 혐기성 100 millimolar 인산칼륨 완충액 pH 7.5로 유로 회로에서 효소 세척액의 성분을 씻어내는 동안 스펙트럼을 획득하십시오. 그런 다음 pro data 제어 소프트웨어에서 baseline을 클릭하십시오.

그런 다음 효소 스톡 용액 200 µL를 혐기성 100 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5) 1000 µL와 혼합합니다. 저장조 시린지 A의 용액을 해당 효소 용액으로 교체합니다.

pro data 제어 소프트웨어에서 A 밸브를 drive 위치로 전환하십시오. stop syringe empty를 클릭하십시오. 해당 drive 램을 수동으로 올려 drive 시린지 A로부터 효소 용액을 유로 회로로 밀어내십시오.

지연 시간을 0.5초로, 획득 시간을 60초로 설정하십시오. 모든 구동 시린지에 해당 용액이 채워져 있는지, 그리고 구동 램이 구동 시린지 피스톤에 닿아 있는지 확인하십시오. 그런 다음 모든 구동 밸브를 구동 위치로 돌리고 pro data 제어 소프트웨어에서 acquire를 클릭하십시오.

산화 형태 효소의 스펙트럼 데이터를 3회 반복 측정하여 얻습니다. 다음으로, 리저버 시린지 B의 용액을 시린지 A의 효소 용액보다 1.5배 더 농축된 N-A-D-P-H 용액으로 교체합니다. B 밸브를 드라이브 위치로 돌리고, 앞서 제어판 창에서 보여준 것과 같이 스톱 시린지를 세 번 비우고 다시 채웁니다.

지연 시간을 0.5초로 설정하십시오. 20초에 획득이 시작되면, 리저버 시린지의 용액을 산소화된 버퍼로 교체하십시오. C 밸브를 드라이브 위치로 돌리십시오.

pro data 제어 소프트웨어에서 세 번 플러싱하십시오. 지연 시간은 15초, 획득 시간은 900초로 설정합니다. stopped flow 장치 내에서 완전히 환원된 효소의 재산화가 일어나는 동안 계속해서 스펙트럼을 획득하십시오.

N-A-D-P-H를 이용한 SID A의 혐기성 환원은 452 nm에서의 흡광도를 통해 플라빈의 산화환원 상태 변화를 측정함으로써 모니터링할 수 있습니다. 산화된 SID A부터 완전히 환원된 SID A의 마지막 스펙트럼까지 시간에 따른 스펙트럼 변화를 기록합니다. 이 효소 단계의 속도는 데이터를 적절한 방정식에 피팅하여 결정할 수 있습니다. 산화 속도 및 반응 중간체 또한 AF Sid A에 의한 이 반응에서 stopped flow의 double mixing 모드를 사용하여 결정할 수 있습니다. C4a-hydroxyflavin 중간체는 380 nm의 최대 흡수 파장(lambda max)으로 명확하게 검출되며, 산화된 효소는 450 nm의 최대 흡수 파장을 가집니다.

이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 4~6시간 이내에 완료할 수 있습니다. 용액이 혐기성 상태를 유지하도록 주의하십시오. 이 영상을 시청한 후에는, 신속 화학 분석과 같은 후속 실험과 독립적으로 FLA의 상대적 및 궤양성 이온을 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

Quentin은 중간체들의 슬픈 특성을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다.