Polyanhydride의 Nanoparticles의 높은 처리량 탄수화물의 합성과 작용화

본 비디오 논문에서는 올리고당의 자동화된 용액상 합성 및 폴리 안하이드라이드 나노입자의 기능화를 위한 새로운 하이드로 풋(hydro put) 프로토콜을 설명합니다. 이러한 탄수화물 기반 표적제 제작을 위해, 먼저 고상 합성기 대신 용액상 합성을 이용하는 자동화 시스템을 사용하여 탄수화물 분자를 합성합니다. 그다음, 올리고당 중간체들을 플로리스트(florist) 고상 추출 또는 FSPE를 통해 정제합니다.

생성된 탄수화물 분자는 NMR로 특성을 분석한 후, 카바이드(carbo IDE) 결합을 통해 폴리 안하이드라이드 나노입자에 부착됩니다. 마지막으로, 탄수화물이 기능화된 나노입자는 X선 광전자 분광법(XPS)과 하이드로풋 페닐 황산 에세이(hydro putt phenyl sulfuric acid assay)를 통해 특성을 분석합니다. 궁극적으로, 여기에 기술된 하이드로풋 방법론을 활용하여 나노입자의 형태와 입자 표면의 탄수화물 밀도를 최적화하기 위한 반응 조건을 확보하였습니다.

고체상 올리고당 합성과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 방법의 주요 장점은 빌딩 블록의 사용량을 상당히 줄일 수 있다는 것입니다. 이 방법에서는 일반적으로 10~20 당량이 아닌 2~3 당량을 사용합니다. 저희는 탄수화물을 사용하여 항-치성 세포의 특정 수용체를 표적화함으로써 폴리 하이드로 나노입자의 기능화 및 표면 효과의 효능을 입증했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 그 후, 이러한 새로운 운반체의 제작 및 적용에 관여하는 여러 매개변수를 스크리닝할 수 있는 고처리량 시스템을 설계하고자 했습니다.

올리고당의 고처리량 합성과 이를 고분자 입자에 부착시키기 위한 자동화 플랫폼 개발은 가용한 문서 자료가 많지 않은 새로운 연구 분야이므로, 본 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. diano acid의 자동 합성 이전에, 일반적으로 tri chloro acetamide인 적절히 보호된 당 공여체와 주로 Alcon, fluorous alcohol인 수용체를 벤치탑에서 합성하여 chloro methane에 준비합니다. 또한 trimethyl silo, tri fluoro methane sulfonate를 chloro methane, 80%methanol 및 100%methanol에 준비합니다. 자동화 챔버 내 실내 상대 습도가 30% 이하인지 확인하십시오.

높은 습도는 당화 반응에 해롭습니다. 다음 단계들은 자동화 플랫폼을 사용하여 수행됩니다. 첫 번째 당화는 공여체와 florist alcohol을 사용하여 수행됩니다.

완료 후, 생성된 florist tag 당 분자를 FSPE로 정제합니다. 그런 다음 sodium methoxide와 methanol을 사용하여 일시적 보호기를 제거하며, 제품을 다시 FSPE로 정제합니다. 이후 florist tag 당을 수용체(acceptor)로 사용하여 동일한 공여체(donor)와 결합시켜 이당류를 얻고, 이당류를 FSPE로 정제하여 준비합니다.

공여체-수용체 프로모터, 80% methanol water, 100% methanol, sodium meth oxide를 포함한 시약들을 로봇 플랫폼에 배치하고 프로그램을 시작합니다. 로봇 팔이 바이알에서 공여체와 수용체를 순차적으로 취해 반응 바이알로 옮깁니다. 그 후, 공여체와 수용체의 혼합물을 30분 동안 교반합니다.

30분이 경과한 후, 로봇 팔이 촉매인 trimethylsily trifluoromethanesulfonate를 혼합물에 투입합니다. 그 후 용액을 30분 동안 추가로 교반합니다. 교반이 완료되면 프로그램이 일시 정지됩니다.

10 µL의 분취액을 취하여 박층 크로마토그래피(TLC)로 반응 완결 여부를 확인하십시오. 반응이 완료되었다면 수용체 분자가 관찰되지 않을 것입니다. 반응이 완료되지 않았다면 TLC 상에서 수용체가 여전히 관찰됩니다.

이러한 경우 프로그램을 중단하고 당화(glycosylation) 타이밍을 약 30분으로 재설정한 후, 프로모터인 trimethyl silo, tri fluoro, methane sulfonate를 과량으로 첨가합니다. 반응이 완료되면 다음 단계로 진행하십시오. 반응이 끝나면 로봇이 정제를 위해 C nine F 17 변형 실리카 겔이 포함된 FSPE 카트리지로 반응 혼합물을 옮깁니다.

다음으로, 카트리지를 80% methanol 8 mL로 세척한 후, 100% methanol 8 mL로 세척합니다. non floris 분획을 제거하기 위해, 통과액을 바이알에 수집하여 원하는 florist 태그 제품을 얻습니다. 추가 정제가 필요한 경우, 로봇을 일시 중지하고 적절한 반응 생성물을 제거하십시오.

구조에 따라 공여체(donor)의 반응성이 매우 낮을 수 있으며, 충분한 촉진제(promoter)를 첨가한 후에도 일부 꽃집 수용체(florist accepter) 분자가 남아 있을 수 있습니다. 이런 경우 FSPE만으로는 정제 효율이 충분하지 않을 수 있으므로, 정제 후 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 통한 추가 정제를 수행할 수 있습니다. 로봇 암이 반응 바이알에 소듐 메톡사이드(sodium meth oxide)를 분주합니다. 이후 로봇 플랫폼에서 2시간 동안 반응물을 교반하며, TLC로 확인했을 때 반응이 완결되지 않았다면 배양 시간을 약 1시간 더 연장합니다.

반응이 완료되면, 이전과 동일하게 FSPE로 생성물을 정제합니다. 다음으로, 로봇에서 반응 생성물을 꺼내 벤치탑에서 무수 톨루엔에 용해시킨 후, 증발시켜 잔류 수분을 제거합니다. 샘플이 건조되면, FSPE를 이용한 당화 정제 과정을 포함하여 동일한 사이클로 로봇에 다시 넣습니다.

표적 분자에 대해 원하는 사슬 길이가 얻어질 때까지 일시적 보호기의 심층 보호와 글리코실화를 반복합니다. 자동화 장치에서 얻은 보호된 생성물을 탈보호하기 위해 로봇에서 바이알을 제거합니다. 절차의 마지막 단계는 폭발성 수소 가스를 사용하므로 자동화 플랫폼 외부에서 수행해야 합니다. 벤치탑에서 플로리스트 태그(florist tag) 내 이중 결합의 오존 분해가 일어나며, 이어 생성된 알데히드가 카르복실산으로 산화됩니다.

디클로로메탄 내 30% 메탄올 혼합액을 사용하여 벤치톱 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 생성물을 정제합니다. 마지막으로, 팔라듐 촉매 수소화 반응을 통해 벤조 에테르 그룹을 탈보호하고, 팔라듐을 제거하기 위해 생성물을 새틀라이트 패드(satellite pad)에 통과시켜 순수한 최종 생성물을 얻습니다. 핵자기 공명 또는 NMR 분광법을 사용하여 생성물의 특성을 완전히 분석합니다.

고처리량 폴리머 합성 및 나노입자 제조는 Peterson 등이 기술한 프로토콜에 따라 수행됩니다. 동봉된 문서에 언급된 바와 같이, 입자 기능화에 사용된 자동 증착 장치는 3개의 ne 1000 펌프, X 방향 이동용 액추에이터 하나와 Y 방향 이동용 액추에이터 하나로 통합된 로봇 스테이지, 그리고 펌프의 각 방향으로 하나씩 총 3개의 액추에이터로 구성된 2개의 인접 랙이 있는 두 번째 로봇 스테이지로 구성됩니다. 총 5개의 액추에이터가 직렬로 연결되어 있으며, 액추에이터와 펌프는 LabVIEW 소프트웨어를 사용하는 컴퓨터에 의해 작동됩니다.

입자 제작에 사용된 공중합체 시스템은 SEBA 산 또는 SA와 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane(CPH) 및 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane(CPTeeg)을 기반으로 합니다. 나노입자 제작 후, 폴리무수물 입자 표면에 탄수화물을 부착시키기 위해 나노입자 라이브러리가 포함된 1.7 mL 원심분리 튜브 랙을 리니어 액추에이터 스테이지에 배치하고, 두 단계의 연속 반응으로 구성된 평균 카르복실산 결합 반응을 수행합니다. 첫 번째 반응을 위해, 프로그래밍 가능한 시린지 펌프의 시린지에 EDC 수용액과 에틸렌디아민 수용액을 나노입자 1 mg당 각각 2 mg 및 0.6 mg의 농도로 채웁니다.

프로그래밍 가능한 시린지 펌프의 두 번째 시린지에 나노입자 샘플당 총 12당량에 해당하는 2.5 mg/mg 입자 농도의 NHSA 수용액을 채웁니다. 다음으로, LabVIEW 프로그램을 사용하여 로봇이 시약 현탁액을 나노입자 라이브러리에 분주하도록 지시합니다. 그러면 로봇 액추에이터가 튜브 홀더를 플랫폼의 정확한 위치로 이동시켜 EDC 및 NHS 용액을 분주합니다.

폴리무수물 나노입자 표면의 카르복실산 그룹을 활성화하여 평균 결합이 가능하도록 합니다. 다음으로, 각 튜브에 초음파 처리 프로브를 담그고 각 시료를 40 hertz에서 30초 동안 초음파 처리합니다. 다음 시료로 넘어가기 전, 아세톤으로 프로브를 세척합니다.

모든 샘플의 포화가 완료되면, 튜브 홀더를 로봇 플랫폼에서 분리합니다. 나노입자 현탁액을 4 °C에서 일정하게 회전시키며 9시간 동안 배양합니다. 최종 당 농도를 조절하기 위해 1차 및 2차 반응 시간을 변경할 수 있습니다.

반응이 완료되면, 튜브를 12,000 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 저온 환경을 유지하며 로봇 스테이션으로 복귀합니다. 튜브 홀더를 로봇 암에 다시 부착하고, 로봇 플랫폼의 두 번째 주사기를 채웁니다.

냉수를 사용할 때, 첫 번째 시린지는 비어 있어야 합니다. 로봇을 작동시킵니다. 각 튜브의 상층액은 빈 시린지로 흡입되고, 두 번째 펌프가 튜브에 냉수를 주입합니다.

이 단계는 나노입자 현탁액에서 반응하지 않은 시약을 제거하기 위해 수행됩니다. 다음으로, 이전에 시연한 바와 같이 초음파 처리를 통해 나노입자 현탁액을 균질화합니다. 그 후 튜브를 12,000 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다.

로봇 장치를 사용하여 냉수로 2차 세척을 수행합니다. 두 번째 반응 부하를 위해 나노입자 샘플당 12당량의 EDC를 첫 번째 펌프에, 나노입자 샘플당 12당량의 NHS를 두 번째 펌프에 넣습니다. 로봇 플랫폼을 작동시켜 나노입자가 포함된 튜브에 적절한 부피를 분주합니다. EDC와 NHS가 존재하면 나노입자 표면에 이미 부착된 ethylene dite의 아민기와 보호된 당의 카복실산기 사이에 아미드 결합이 형성됩니다.

증착이 완료되면 특정 당류 10당량을 로드합니다. 본 실험에서는 유당(lactose)과 사용 가능한 두 개의 펌프에 글리콜산(glycolic acid) 대조군을 사용하였습니다. 각 당류는 각 튜브에서 달성하고자 하는 기능화 목적에 따라 시험관에 증착되며, 이는 해당 반응에 사용되는 액추에이터 및 펌프 기능을 작동시키기 위해 활용되는 lab view 프로그램에 사전에 프로그래밍되어 있습니다. 본 연구에서 탄수화물 부착을 위해 글리콜산을 링커 대조군으로 사용하는 이유는, 고도로 보호된 당류에 이미 이 분자가 공유 결합으로 연결되어 있어 나노입자 표면에 추가로 부착될 수 있기 때문입니다.

나노입자 현탁액을 이전과 동일하게 초음파 처리하여 균질화한 후, 4°C에서 지속적으로 회전시키며 9시간 동안 배양합니다. 배양 후 나노입자 현탁액을 원심분리하여 상층액을 제거함으로써 세척하고, 펠렛을 차가운 물에 다시 현탁시킨 후 초음파 처리합니다. 기능화된 나노입자 라이브러리가 포함된 튜브를 진공 챔버에 넣고 최소 2시간 동안 건조합니다. 기능화된 나노입자는 동적 광산란법 및 기타 방법으로 분석하여 표면 조성, 농도, 입자 크기, 크기 분포 및 표면 전하를 평가합니다.

여기에 표시된 완전히 보호된 diano 측쇄는 자동화 플랫폼을 사용하여 합성되었습니다. 합성된 화합물은 VXR 400 megahertz 분광계의 proton NMR을 통해 특성을 분석하였습니다. CDC 13을 용매로 사용하였으며, 몇 가지 특징적인 피크의 존재를 통해 생성물의 형성을 확인할 수 있습니다.

프로톤 NMR 도표에서 1.79에서 2.21 사이의 프로톤 4개와 3.38의 프로톤 2개는 florist tag에서 유래한 것입니다. 2.16의 싱글렛 피크는 아세테이트 피크에 해당하며, 4.94와 5.11의 피크는 나노입자의 최종 형태와 당 결합 정도에 반응 시간이 미치는 영향을 평가하기 위한 아노머 프로톤(anomeric protons)입니다. 여기에서 보여지는 바와 같이 반응 시간을 늘림에 따라 나노입자가 기능화되었으며, 50 50 CPT CPH 나노입자 표면의 diano 농도는 총 반응 시간에 따라 증가하여 18시간 후에 최대치에 도달했습니다.

총 반응 시간이 24시간인 기능화된 나노입자를 사용하여, 여기에서 보여주는 바와 같이 유세포 분석법을 통해 마우스 골수 유래 수지상 세포의 CLR 표적 능력을 평가했습니다. 기능화되지 않은 나노입자와 락토오스 및 다노로 기능화된 나노입자로 자극한 후, C형 렉틴 수용체에 대한 DC-SIGN 및 mannose 수용체의 발현 증가가 관찰되었습니다. 이는 효과적인 표적화가 이루어졌음을 나타냅니다.

하지만 Diano로 기능화된 입자는 더 높은 발현 수준을 보였으며, 이는 연구된 수용체에 대해 이 리간드가 특이성을 가짐을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 올리고당의 고처리량 자동 합성뿐만 아니라 고분자 나노입자의 기능화 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 탄수화물 기반 표적 제제를 사용하여, 공여체 및 수용체 보호당의 합성과 장치 조립법을 숙달하면 24~48시간 이내에 완료할 수 있습니다.

물론 소요 시간은 라이브러리의 크기와 기능화 시간에 따라 달라집니다. 이 방법을 수행할 때, 나노입자의 화학적 성질에 따라 생분해성 폴리 하이드로 입자의 기능화 반응 조건을 최적화할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차를 따르면 다양한 구조의 탄수화물을 합성할 수 있으며, 이를 통해 서로 다른 세포 수용체를 표적으로 삼아 면역학적 결과에 영향을 줄 수 있습니다.