조합의 합성과 고분자 필름과 Nanoparticle 도서관에서 높은 처리량 단백질 출시

이 영상에서는 생분해성 poly anhydride 필름 및 나노입자 라이브러리의 조합 합성법과, 이러한 라이브러리로부터 단백질 방출을 측정하는 고처리량 검출법에 대해 설명합니다. 먼저, 성분이 다양한 단량체 배열을 유리 큐벳에 증착시키기 위해 고처리량 자동 증착 장치를 사용합니다. 이후 180 °C, 0.3 tor 조건에서 1.5시간 동안 축중합 반응을 수행합니다.

이 반응 조건은 C-P-H-S-A 폴리 무수물 중합체 합성에 특화된 것입니다. 자동 증착 장치를 사용하여, 용매와 캡슐화를 위한 모든 성분을 폴리머 라이브러리가 포함된 큐벳에 증착합니다. 폴리머의 완전한 용해와 추가 성분의 균일한 분산을 보장하기 위해 초음파 처리를 수행할 수 있습니다.

그 후, 용해된 폴리머를 비용매 튜브로 옮겨 나노 침전법을 통해 나노입자 라이브러리를 제작합니다. 나노입자는 진공 건조 또는 여과를 통해 회수되며, 수정된 96-웰 방출 플레이트로 옮겨집니다. 마지막으로, 단백질이 탑재된 라이브러리를 생리학적 조건에서 배양하고 형광 공간 검출법을 사용하여 단백질 방출 역학을 평가합니다.

최종적으로, 폴리머 특성 또는 방출 환경 조건에 따른 단백질 방출 역학을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 기존의 단일 샘플 분석 기술과 비교하여 이 접근법의 주요 장점은 여러 샘플을 동시에 합성할 수 있다는 점입니다. 이렇게 합성된 샘플들은 단백질-폴리머, 세포-폴리머 또는 호스트-폴리머 상호작용에 대해 고효율로 스크리닝될 수 있습니다.

이는 약물 전달 및 조직 공학을 위한 이러한 바이오 소재의 합리적 설계와 개발을 가속화합니다. 실험 절차는 본 연구실의 박사후 연구원인 La Tricia Peterson이 시연하겠습니다. 비디오의 이 섹션에서는 고분자 합성을 마친 후, 조성이 다양한 단량체 라이브러리를 증착하기 위해 고처리량 증착 장치를 사용합니다.

이 장치는 공백 또는 단백질이 탑재된 폴리머 필름 또는 나노입자의 조합 라이브러리를 제작하는 데 사용됩니다. 자동화 플랫폼은 컴퓨터에 직렬로 연결된 두 개의 프로그래밍 가능 시린지 펌프와 세 개의 리니어 액추에이터로 구성됩니다. LabVIEW 소프트웨어를 사용하여 시린지 펌프와 액추에이터에 명령을 전달합니다.

10 cc gast tight 시린지를 시린지 펌프에 장착하고 루어 락 피팅을 통해 금속 모세관을 연결하여, 폴리머 용액을 유리 큐벳에 분사합니다. 본 시연에서는 세익산(seic acid) 또는 SA를 1:6 비율의 비스 파라-옥시헤이산(Biss para oxy heane) 또는 CPH와 함께 사용하여 Texas Red Boan serum albumin을 캡슐화한 나노입자 라이브러리를 제작합니다. 이 비디오와 첨부 문서의 지침을 응용하여 다양한 폴리머 필름 및 나노입자 라이브러리를 제작하고 테스트할 수 있습니다.

라이브러리를 합성하려면 먼저 각 단량체를 클로로포름에 녹여 최종 농도가 25 mg/mL가 되도록 유리 바이알에 넣어줍니다. 다음으로, 루어 락(lure lock) 끝부분을 통해 용액을 흡입하여 각 용액을 10 cc 가스 밀폐형 주사기에 채웁니다. 이때 기포가 있으면 모두 제거합니다.

다음으로, 용매 내성이 있는 루어 락(lure lock) 스테인리스 스틸 모세관을 주사기 끝에 연결합니다. 모세관을 클램프로 고정한 뒤 링 스탠드에 부착합니다. 그런 다음 두 모세관의 끝부분을 시작 뷰렛(starting vete) 안에 위치시킵니다.

모노머 증착을 위한 단계입니다. 프로그래머블 시린지 펌프에 시린지를 장착하고 LabVIEW 소프트웨어에서 위치를 고정합니다. 소프트웨어에서 선형 액추에이터를 시작 위치로 설정하십시오.

x, y, z축을 통해 유리 큐벳에 SA 및 CPH 단량체를 자동 증착합니다. 액추에이터가 모세관을 각 큐벳의 적절한 위치에 배치하고, 프로그램된 부피의 각 단량체를 펌핑하여 조성이 다양한 단량체 라이브러리를 생성합니다. 단량체 증착 후.

단량체 라이브러리를 예열된 진공 오븐으로 옮기고, 축합 중합이 가능하도록 180 °C 및 0.3 torr에서 1.5시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 폴리머 라이브러리의 제작이 완료됩니다. 다음으로 단백질이 적재된 폴리머 나노입자를 생성합니다.

단백질 함유 나노입자 라이브러리를 제작하려면 단백질 함유 폴리머 필름 라이브러리 제작 관련 동반 프로토콜을 참조하십시오. 이 경우, 폴리머 라이브러리를 용해할 수 있는 적절한 용매에 단백질인 Texas red bovine serum albumin을 첨가합니다. 여기서는 2 mg/mL 농도의 methylene chloride를 사용합니다.

10 cc 시린지에 Texas Red BSA 포함 용매를 채우고 첫 번째 시린지 펌프에 장착하십시오. 그런 다음 깨끗하고 비어 있는 2 cc 시린지를 두 번째 시린지 펌프에 장착하고, 바이알 플랫폼 옆의 튜브 홀더에 비용매(이 경우 펜탄) 15 milliliters가 담긴 튜브를 배치하십시오. 그다음 LabView 소프트웨어에서 프로그램을 선택하여 자동 용매 증착 공정을 시작하십시오.

프로그램을 시작하면, 폴리머 라이브러리가 포함된 큐벳에 용매가 주입되어 폴리머 농도가 20 mg/mL가 됩니다. 모든 용매가 주입되면, 폴리머가 용해될 때까지 1~5분 동안 기다립니다. 그 후, 폴리머의 완전한 용해와 균일한 단백질 분산을 보장하기 위해 선택적으로 교반(syndication) 과정을 수행합니다.

다음으로, lab view에서 샘플 전송 프로그램을 시작합니다. 라이브러리의 각 용해된 폴리머 샘플을 빈 시린지로 흡입하여 샘플 홀더에 있는 해당 비용매 튜브에 분주합니다. 각 샘플의 전송이 완료되면, 나노입자 라이브러리를 10 millimeters of mercury 진공 상태의 진공 챔버에 넣거나, 용매가 제거될 때까지 진공 여과를 실시하여 단백질이 로딩된 나노입자를 회수합니다.

캡슐화된 BSA의 방출을 조사하기 위해, 인접한 매 두 번째 열의 각 웰 벽 상단 0.5인치를 제거하여 변형한 딥 96웰 폴리프로필렌 플레이트를 준비합니다. A열과 B열, C열과 D열, E열과 F열, G열과 H열 사이의 각 웰 상단을 제거하면, 최대 용량까지 채웠을 때 인접한 웰 쌍 사이에 액체가 흐를 수 있습니다. 1000에서 10 µg/mL 범위의 Texas red BSA 표준 용액을 딥 96웰 플레이트에 넣습니다.

이는 단백질 양을 계산하는 데 사용되며 형광색소 소광 현상 또한 고려할 것입니다. 원하는 질량의 나노입자를 PBS 완충액으로 재구성한 후, 초음파 처리를 하여 입자를 균일하게 분산시킵니다. 다음으로, 나노입자 라이브러리를 딥 96웰 플레이트로 옮기고 샘플이 웰 플레이트 바닥에 가라앉을 때까지 기다립니다. 그런 다음, 피펫을 사용하여 모든 인접한 웰에 PBS 완충액을 웰 상단에서 1/4인치 지점까지 천천히 채웁니다.

인접한 웰들 사이에 버퍼가 충분히 있어 웰 간에 자유롭게 흐를 수 있어야 합니다. 그다음, 릴리스 플레이트를 뚜껑으로 밀봉하고 37 °C에서 교반하며 놓아둡니다. 실험 기간 동안 정해진 시간 간격마다 9, 400 Typhoon 평판 형광 스캐너를 사용하여 적절한 들뜸, 레이저 및 방출 필터로 플레이트를 스캔합니다.

스캔 후, 이미지 정량 소프트웨어를 사용하여 각 방출 단계에서 방출된 형광색소 결합 단백질의 양을 정량화합니다. 폴리머 화학에 따른 단백질 방출 역학을 결정하기 위해, 이 비디오에서 설명한 대로 SA 및 CPH 단량체로부터 합성된 폴리머 나노입자 라이브러리에 Texas Red BSA를 캡슐화했습니다. 단백질이 탑재된 나노입자를 37 °C에서 한 달 동안 배양하였으며, 이 기간 동안 단백질 방출 정량화를 위해 점진적인 시점마다 형광 스캔을 수행했습니다.

여기에서 보여주는 바와 같이, 이 하이드로 처리량 방법은 A-C-P-H-S-A 폴리 무수물 나노입자 라이브러리로부터 Texas Red BSA 방출 동역학을 결정하는 데 활용되었습니다. Sarich 필름 화학 조성에 따라 방출 속도가 증가하는 화학 의존적 경향이 관찰되었습니다. 표준 단백질 정량 분석법을 사용했을 때도 유사한 결과가 얻어졌습니다.

별도의 실험에서, CPT CPH 폴리무수물 필름 라이브러리(Poly Anhydride Film Libraries)로부터의 Texas Red BSA 방출을 평가한 결과, 여기에서 보시는 바와 같이 0차에 가까운 방출 속도론이 관찰되었으며, cpeg 함량이 높은 필름에서 단백질이 가장 빠르게 방출되어 생분해성 약물 전달 장치로서 의료 분야에 응용 가능성을 보여주었습니다. 이러한 결과는 고분자 화학 구조를 변경함으로써 치료제나 백신 항원의 원하는 방출 프로필을 조절할 수 있음을 나타냅니다. 이 절차에 이어, 단백질 안정성, 세포 독성, 세포 활성화 및 InVivo 생체 내 분포와 같은 분야를 조사하기 위한 다른 조합 방법들이 개발되었습니다.

이러한 측면들은 약물 전달 및 조직 공학을 위한 생체 재료의 합리적 설계에 있어 중요합니다. 본 프로토콜의 전 과정 동안 적절한 개인 보호 장구(PPE)를 착용하고 안전한 실험실 절차를 준수하시기 바랍니다.