높은 처리량 마이크로 캡슐 단일 셀 및 다중 셀

소량의 피코리터 크기 액적에 캡슐화된 세포를 이용하는 응용 분야들은 액적당 세포 수를 제어할 수 없다는 점으로 인해 종종 제한을 받아왔습니다. 본 프로토콜에서는 유체 역학적 세포 정렬과 유동 집속 마이크로 노즐에서의 액적 생성이라는 두 가지 서로 다른 미세유체 현상을 결합하여 세포 캡슐화를 제어하는 방법을 제시합니다. 상류 채널에서 세포나 입자가 현탁된 수용액을 충분히 높은 유량으로 공급함으로써, 하류 흐름 방향으로 동일한 간격을 가진 열을 형성하게 합니다.

계면활성제로 안정화된 허용 오일 담체 유체 내에서 킬로헤르츠(kHz) 속도로 수성 액적을 형성하기 위해 유동 집중 액적 생성 노즐을 사용합니다. 이후 수성 및 오일 유속을 조절하여 액적 생성 속도를 노즐에 도달하는 종방향 정렬 세포 또는 입자의 도달 시점에 동기화함으로써, 정렬된 세포 입자 열을 액적 생성과 결합하며, 이때 입자는 세포 대용물로 사용됩니다. 이 프로토콜을 입증하기 위해서는 유속을 충분히 낮게 설정하여 유체를 제한해야 합니다.

생물학적 세포에 가해지는 전단 응력, 세포 배열의 중첩, 액적 생성 및 세포 생존율을 분석하였습니다. 수성 유량 제한은 단일 및 다중 세포의 제어된 캡슐화를 위한 이상적인 작동 범위를 제공합니다. 비디오 현미경 데이터 분석 결과, 단일 및 이중 세포 또는 입자 캡슐화 효율이 무작위 캡슐화 효율보다 우수하며, 원하는 수의 세포나 입자가 포함되지 않은 액적의 수를 크게 줄이는 것으로 나타났습니다.

세포와 액적의 가둠은 벌크 현탁액과 비교했을 때 세포 분비물의 희석을 제한하고 세포의 이질성을 부각시키며 세포 간 신호를 제어합니다. 이러한 세포들을 액적 내에 캡슐화하는 효율적인 수단은 생물학 연구자들에게 가치 있는 도구를 제공합니다. 이 절차를 시작하기 위해, AutoCAD 소프트웨어에서 이 그림에 표시된 것과 같이 마이크로채널 패턴을 설계하십시오.

긴 채널 섹션은 너비가 27 µm인 수성 흐름 정렬 채널을 나타냅니다. 확대된 노즐 도식에서는 수성 정렬 채널과 오일 채널의 너비가 모두 27 µm로 동일하며, 이어서 22 µm의 노즐 수축 구간을 거쳐 너비 61 µm의 더 넓은 채널로 급격히 확장되는 구조를 보여줍니다. 장치의 높이는 52 µm입니다.

수성 및 유성 유입구 모두에 유성 유입구의 확대 모식도에서 보여주는 바와 같이 정렬 채널 너비 수준의 간격을 가진 대형 이물질 필터가 설치되어 있습니다. 여기는 염료가 주입된 정렬 채널과 노즐의 실제 이미지입니다. 어두운 배경에 채널 부분이 투명하게 처리된 고해상도 투명 마스크를 Mylar 필름 또는 쿼츠 위에 인쇄하기 위해 외부 전문 업체를 이용하십시오.

이어서 복제 성형(replica molding)을 위한 실리콘 및 SU-8 포토레지스트 마스터를 제작합니다. PDMS 복제 성형을 위해 마스터 몰드를 페트리 접시 바닥에 테이프로 고정합니다. 복제 성형이 완료되고 장치의 외곽선을 따라 절단한 후, 외경 0.75 millimeter 생검 펀치(biopsy punch)를 사용하여 그림에 표시된 세 개의 원형 영역에 유체 포트를 뚫습니다. 플라스마 본딩 후에는 PDMS의 패턴 면에 스카치 테이프를 붙였다 떼어내어 먼지를 제거합니다.

PDMS를 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 부착합니다. 장치 전체를 오븐에 넣고 온도를 120 °C까지 점진적으로 올립니다. 결합을 완료하고 PDMS를 원래의 소수성 상태로 되돌리기 위해 장치를 120 °C 오븐에 하룻밤 동안 둡니다.

채널의 유리 표면을 소수성으로 만드는 대체 방법은 aquae와 같은 코팅제를 유체 포트로 주입한 후 공기로 퍼지(purge)하는 것입니다. 1 mL 주사기와 주사 바늘을 사용하여 공기 수백 µL를 흡입한 후, 금속 주사기 팁을 채울 정도의 아주 적은 양의 aquil을 흡입합니다. 주의 깊게, 하지만 단단하게 aquil을 주입한 다음 퍼지용 공기를 유체 포트로 주입하십시오. 이때 PDMS와 유리의 결합이 강하게 파손되지 않도록 주의하십시오.

건조 시 채널을 막을 수 있는 침전물이 생기는 것을 방지하기 위해, 모든 유입구 및 유출구 포트의 공기 퍼지를 반복하면서 과도한 수분을 닦아냅니다. 적절한 수의 방울에 적절한 수의 세포가 포함되도록 하려면 세포 농도를 조절하는 것이 필수적입니다. 여기에는 두 가지 까다로운 요소가 있습니다.

첫 번째는 적절한 농도를 사전에 추정하는 것이며, 두 번째는 실험 중에 해당 농도를 유지하는 것입니다. 본 연구에 사용된 특정 장치의 경우, 제어된 캡슐화를 위해 8~15 micron 크기의 세포 또는 입자가 적절합니다. 본 시연에서는 9.9 micron 크기의 polydiary 미세구체를 세포 대용물로 사용합니다. 이상적인 캡슐화를 달성하기 위한 수성 입자 현탁액 농도를 준비하려면, 완전한 정렬을 위한 이전 데이터를 사용하여 1% solids(중량 기준)의 미세구체 스톡 농도로 시작하십시오. 가이드라인으로서, 스톡 샘플 1 mL를 부드럽게 원심분리하여 상층액 250 µL를 제거하고, 볼텍스 믹싱 또는 더 부드러운 혼합 방식으로 입자를 재현탁함으로써 농도를 1.5% solids로 높이십시오.

본 영상에는 나타나지 않았으나, 세포를 사용할 때 세포와 폴리스티렌 입자 모두 비중이 1보다 큽니다. 수 분에서 수 시간 정도 지속되는 장기 실험의 경우, 입자에는 염화칼슘과 같은 용질을, 세포에는 opti prep을 첨가하여 용액의 부력을 맞출 수 있습니다. 세포 또는 입자 현탁액이 준비되면, 15 mL 원심분리관에 10 mL의 연속상 플루오로카본 오일 샘플을 준비한 후 볼텍싱합니다.

계면활성제와 플루오로카본 오일을 약 2.5% w/w 비율로 혼합합니다. 본 실험에서는 2.4 w/w 혼합물을 얻었으며, 이는 마이크로 캡슐화 실험을 설정하는 데 적절한 수치입니다. 먼저, 도립 광학 현미경과 고속 카메라의 전원을 켭니다.

마이크로채널 층에 집중하여 채널 내에 막힘이나 떨어져 나올 수 있는 잔해물이 있는지 검사하십시오. 큰 잔해물이나 뚜렷한 막힘이 없는 채널을 선택하십시오. 데드 볼륨을 최소화하기 위해 수성 입구, 오일 입구 및 에멀젼 출구용으로 반투명 tigon PVC 튜빙을 세 개의 길이로 절단하십시오.

시린지 펌프에서 현미경까지 닿을 정도의 튜브를 절단합니다. 유체 포트에 삽입하기 쉽도록 튜브 끝단을 45도 각도로 자릅니다. 핀셋을 사용하여 튜브 끝단을 유체 포트에 압입하여 고정합니다. 그런 다음, 수성 유입 튜브의 빈 끝단에 30 gauge 뭉툭한 팁의 스테인리스 스틸 시린지 바늘을 압입하여 고정합니다.

오일 유입 튜브에 대해서도 동일하게 반복합니다. 장치를 이동시키고 튜브를 현미경 스테이지에 부착한 후, 20배 대물렌즈를 사용하여 장치 노즐의 정렬 및 초점을 맞춥니다. 초점 평면에서 최적의 조명을 제공할 수 있도록 현미경의 쾰러 조명(Kohler illumination)을 수동으로 조절합니다.

고속 카메라 소프트웨어를 사용하여 노즐 주변의 시야를 크롭함으로써 프레임 속도를 높인 다음, 최적의 녹화에 필요한 프레임 속도, 노출 시간 및 기타 카메라 설정을 설정하십시오. 그다음, 이전에 준비하여 잘 혼합된 수상 용액을 1 mL 주사기에 채우십시오. 유상 용액은 3 mL 주사기에 채우십시오.

충전된 주사기 중 하나를 수직으로 세우고 톡톡 쳐서 공기 방울을 주사기 배출구 쪽으로 이동시킵니다. 주사기를 수직으로 세운 상태에서 플런저를 천천히 눌러 공기가 주사기 팁까지 밀려 나갈 때까지 충분히 누릅니다. 주사기를 장치에 이미 장착된 해당 주사기 바늘에 연결합니다.

플런저를 눌러 시린지 바늘의 데드 볼륨을 통해 공기를 밀어내어, 액체가 튜빙을 타고 장치 직전까지 도달하게 합니다. 시린지를 시린지 펌프에 단단히 고정하고 플런저 블록을 체결합니다. 두 번째 시린지도 동일하게 연결한 후 두 번째 시린지 펌프에 장착합니다. 각 시린지 펌프의 전원을 켜고 설정을 프로그래밍합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 초기 유량을 오일 상은 50 µL/min, 수용액 상은 5 µL/min으로 설정합니다.

수성상 시작 시, 펌프는 각 유체가 장치에 진입하여 채널을 채우고 남아 있는 공기를 밀어낼 때까지 대기합니다. 초기 유속을 사용할 경우 이 과정에 수 분이 소요될 수 있습니다. 노즐에서 액적이 형성되는지 관찰하십시오.

수용액 유량을 천천히 증가시켜 긴 수용액 솔루션 채널 내에서 입자들이 정렬되는 것을 관찰하십시오. 유량을 증가시킬 때, 다른 액적 생성 노즐을 사용한 이 예시에서 보이는 것처럼 노즐에서 수용액 흐름의 제팅(jetting)이 유발되는 지점까지 유량을 높이지 마십시오. 여기서 불안정한 흐름과 일관성 없는 액적이 나타납니다. 입자 농도가 너무 낮아 누락되는 입자가 상대적으로 적은 교차 열을 형성하지 못하고 샘플의 부력이 일치하지 않는 경우, 시린지 펌프를 시린지 배출구 쪽으로 물리적으로 기울여 입자들이 시린지 배출구 쪽으로 서서히 가라앉도록 하십시오.

적절한 정렬이 이루어지면, 오일 유량을 조절하여 드롭의 생성 빈도와 크기를 조정합니다. 원하는 캡슐화율과 드롭 부피를 얻을 때까지 두 유량을 반복적으로 조절하십시오. 안정적인 정렬 캡슐화가 확인되면, 배출 튜브를 폐기물 저장조에서 꺼내 향후 사용을 위한 수집 저장조로 옮깁니다.

단일 및 이중 입자 또는 세포 캡슐화를 높은 효율로 달성할 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜을 이용한 대표적인 단일 입자 캡슐화 결과는 오일 유속 60 µL/min 및 수성 유속 9 µL/min 조건에서의 결과입니다. 방울당 평균 입자 수인 람다(Lambda) 값은 0.95입니다.

완전히 정렬된 교차 입자의 경우 흐름 방향으로의 입자 간격은 약 17~18 microns입니다. 이 예시에서 액적 생성률은 6.1 kilohertz이며 평균 액적 크기는 24.4 picoliters입니다. 히스토그램은 단일 입자 캡슐화의 순서와 더하기(+)가 있는 경우의 액적 캡슐화 입자 효율을 비교하여 보여줍니다.

통계적으로, 517개 액적의 표본 크기에 대한 무작위 캡슐화의 경우, 하나의 입자를 포함하는 액적의 평균 분율은 79.5%였으며, 이는 예측된 무작위 캡슐화 분율인 36.7%와 대조됩니다. 491개 입자의 표본 크기에서 적절하게 캡슐화된 액적에 포함된 입자의 분율은 83.7%로 관찰된 반면, 무작위 캡슐화 분율은 37.3%였습니다. 수성상 유량을 9 microliters per minute로 유지하면서 오일 유량을 30 microliters per minute로 줄임으로써 간단하게 이중 입자 캡슐화를 달성할 수 있습니다. 여기서 액적당 평균 입자 수인 lambda는 1.8입니다. 이는 단일 입자 캡슐화와 유사합니다.

완전하게 정렬된 교대 입자의 경우 흐름 방향으로의 입자 간격은 약 17에서 18 µm입니다. 더 큰 액적의 평균 크기는 39.8 pL이며, 무작위 캡슐화와 비교하여 3.8 kHz의 속도로 형성되었습니다. 383개의 액적 샘플 크기에서, 두 개의 입자를 포함하는 정렬된 캡슐화 액적의 평균 분율은 71.5%였으며, 이는 예측된 무작위 캡슐화 분율인 26.8%와 대조됩니다. 689개의 입자 샘플 크기에서 올바르게 캡슐화된 액적에 포함된 입자의 분율은 79.5%로 관찰된 반면, 무작위 캡슐화 분율은 33.4%였습니다.

종합하면, 이러한 결과는 단일 및 이중 입자 캡슐화 효율이 무작위 캡슐화 효율보다 2배 이상 뛰어나며, 원하는 수의 세포나 입자를 포함하지 않는 액적의 수를 크게 줄인다는 것을 보여줍니다. 높은 캡슐화 효율을 위해 적절한 입자 또는 세포 농도가 중요하다는 점이 이번 실험 과정에서 잘 나타납니다. 오일 및 수상 유속은 앞서 보여준 이중 입자 캡슐화 실행 시와 동일하지만, 액적당 평균 세포 수인 lambda는 1.57로 감소되었습니다.

결과적으로 완전한 정렬이 일어나지 않아 트레인 내에 빈 공간이 생기며, 이로 인해 예상보다 적은 수의 입자를 포함한 선 드롭(sun drops)이 생성됩니다. 이 히스토그램은 Lambda 값이 낮아짐에 따라 두 개의 입자를 캡슐화하는 효율이 감소함을 보여줍니다. 324개 드롭의 표본 크기에서 두 개의 입자를 포함하는 드롭의 평균 비율은 55.9%였으며, 단일 입자 드롭의 수가 이중 입자 드롭의 수와 거의 비슷했습니다.

이는 드롭당 캡슐화되는 입자나 세포의 수를 최대화하기 위해, 드롭당 허용 가능한 세포 수가 적은지 많은지에 따라 람다(Lambda) 값을 선택하여 람다가 원하는 드롭당 세포 수와 같거나 그에 가깝게 설정되어야 함을 나타냅니다. 본 시연에서는 부력 불일치를 이용하여 실험 중 농도를 실시간으로 제어합니다. 하지만 장기 실험의 경우, 세포를 수성 드롭 내에 캡슐화한 후 더 일관된 결과를 얻기 위해 부력을 맞추는 것이 권장될 수 있습니다.

시간 의존적 실험은 원심분리 튜브 내에서 수행하거나, 미세유체 어레이에 액적을 다시 주입하여 현미경 하에서 수행할 수 있습니다.