자동을 사용하여 염색체의 높은 처리량 물리적 매핑

본 실험 절차의 전체적인 목표는 고압 염색체 표본 제작법을 통해 모기의 다사 염색체(polytan chromosomes)에 DNA 프로브를 매핑하고, 이어서 자동화된 형광 인시튜 하이브리다이제이션(fluorescent in situ hybridization) 및 자동 영상 촬영을 수행하는 것입니다. 이는 우선 고압법을 사용하여 다사 염색체 도말 표본을 제작함으로써 이루어집니다. 다음 단계는 닉 번역(Nick translation) 프로토콜을 사용하여 게놈 DNA를 형광 염료로 표지함으로써 형광 프로브를 제작하는 것입니다.

세 번째 단계는 자동 슬라이드 염색 시스템을 사용하여 형광 제자리 하이브리드화(fluorescent in situ hybridization)를 수행하는 것입니다. 마지막 단계는 자동 형광 이미징 시스템을 사용하여 표지된 염색체를 스캔하고 촬영하는 것입니다. 결과적으로, 이미지를 통해 다가 염색체(poly chromosome) 상의 형광 표지된 DNA 프로브의 위치를 확인할 수 있습니다.

표준 수동 in situ hybridization 프로토콜과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 고처리량 물리적 매핑 프로토콜이 더 일관된 결과를 생성하며 수작업 시간을 획기적으로 단축한다는 점입니다. 이 프로토콜은 흡혈 후 약 25시간이 지난 시점에 암컷을 해부하여 난소가 Stage 3 단계일 때 수집하는 것으로 시작합니다. 이 단계에서는 여포 내의 영양세포가 있는 투명한 영역이 둥근 모양을 띠어야 합니다. 암컷 5마리로부터 난소를 수집하여 500 µL의 갓 제조한 수정된 Carnoy 용액에 고정합니다.

그런 다음 실온에서 최대 24시간 동안 또는 -20°C에서 더 오랫동안 보관할 수 있습니다. 다음으로, 난소 해부 슬라이드를 만들기 직전에 칼노이즈(carnoy) 용액과 50% propionic acid를 준비합니다. 해부 현미경 아래에서 먼지가 없는 슬라이드 위의 신선한 칼노이즈 용액 한 방울에 각각의 난소 쌍을 넣습니다.

해부용 바늘을 사용하여 난소를 분리합니다. 분리된 모든 난소 조각을 50% propionic acid가 담긴 6개의 깨끗한 슬라이드로 옮깁니다. 해부용 바늘을 사용하여 여포들을 서로 분리합니다.

그런 다음 남은 조직을 페이퍼 타월로 닦아냅니다. 50% propionic acid를 한 방울 더 추가하고 3~5분 동안 기다립니다. 참고로, 모낭을 50% propionic acid에 3~5분 동안 두면 염색체 퍼짐 현상이 현저히 개선됩니다.

다음으로, 커버슬립을 덮고 핵이 퍼질 때까지 1분 더 기다립니다. 슬라이드를 거름종이와 플라스틱으로 감쌉니다. 드레멜(Dremel)의 회전 속도를 3,000에서 5,000 RPM 사이로 설정하고, 약 1분 동안 회전하는 드레멜 팁으로 커버슬립 위를 가볍게 원을 그리며 문지릅니다.

위상차 현미경으로 도말 상태를 확인하고, 염색체를 평평하게 펴기 위해 필요한 경우 드레멜(dremel)을 더 오래 적용하십시오. 첫 번째 커버 슬립 옆에 두 번째 커버 슬립을 배치한 다음, 다른 현미경으로 커버 슬립들을 샌드위치처럼 누릅니다. 다음으로 슬라이드를 플라스틱 시트와 여과지로 감싼 후, 랩핑된 슬라이드를 바이스에 고정하여 85~120 inch pounds의 힘으로 압착하십시오.

6개의 슬라이드 모두에서 염색체를 평탄화한 후, 슬라이드 랩을 벗기고 추가 슬라이드를 제거하여 염색체를 더욱 평탄화합니다. 슬라이드 변성 하이브리다이제이션 시스템에서 55 °C로 10~15분 동안 배양합니다. 다음으로, 슬라이드를 액체 질소에 최소 15초 동안 또는 기포 발생이 멈출 때까지 담급니다.

그런 다음 면도날을 이용해 커버 슬립을 빠르게 제거하고, 즉시 슬라이드를 차가운 50% ethanol에 5분 동안 담급니다. 각 슬라이드에 대해 이 과정을 순차적으로 반복합니다. 70%, 90% 그리고 100% ethanol 용액에 담가 슬라이드를 탈수시킵니다.

각 수조에 5분 동안 담급니다. 마지막으로, 슬라이드를 공기 중에서 건조시키면 염색 준비가 완료됩니다. 프로브 표지를 제외한 절차의 대부분의 단계는 자동화 기기가 수행합니다.

장치에 로딩하기 전, 상용 NIC 변환 프로토콜을 사용하여 형광색소로 back DNA를 표지하여 형광 프로브를 준비하십시오. 프로브가 준비되면 슬라이드와 시약을 자동 슬라이드 염색 시스템에 로딩하고, 시스템이 다음 단계를 수행하도록 프로그래밍하십시오. 먼저, 800 µL의 1x PBS를 20분 동안 공급합니다.

둘째, 슬라이드를 드라이어로 건조합니다. 셋째, 1 XPBS 내의 4% formalin 450 µL를 사용하여 슬라이드를 1분 동안 고정합니다. 그런 다음 100% ethanol로 1초씩 두 번, 그리고 2분 동안 슬라이드를 세척합니다.

에탄올 배스 처리 후, 슬라이드를 다시 바람으로 건조합니다. 기포 발생을 방지하기 위해 슬라이드를 45 °C에서 2분 동안 가열합니다. 그 다음 20 µL의 DNA 프로브를 도포하고, 미네랄 오일 한 방울과 커버 슬립을 순서대로 덮은 후, 염색체를 90 °C에서 10분 동안 가열합니다.

그 다음 슬라이드를 42°C에서 14시간 동안 혼성화시킵니다. 혼성화 후 42°C에서 2분 동안 엄격성 세척(stringency washes)을 수행하고, 이어서 2 XSSC를 1초씩 4회 연속 적용한 후 건조시킵니다. 그런 다음 0.4 XSSC 800 µL를 42°C에서 10분 동안 2회 적용하고, 추가로 1회 더 세척한 후 25°C에서 2 XSSC로 10분 동안 세척합니다.

이제 염색약인 50 µL의 YO-YO-1을 처리한 후, 미네랄 오일과 커버글라스를 덮습니다. 슬라이드를 25 °C에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 커버글라스를 제거합니다.

슬라이드를 2X SSC로 1초씩 4회 세척한 후, 바람을 불어 건조시킵니다. 마지막으로, 각 슬라이드에 prolonged gold anti fade reagent 15 µL를 도포하고 새 커버슬립을 덮습니다. 할로겐 램프용 Olympus U-R-F-L-T 전원 공급 장치부터 시작하여 Accord plus 자동 스캐닝 시스템의 전원을 켭니다.

그 다음 컴퓨터를, 마지막으로 카메라가 부착된 현미경을 켭니다. 이제 duet 소프트웨어 패키지를 먼저 실행하여 10x 사전 스캔(pre-scan)을 설정하십시오. 온라인 버튼을 클릭하고, 새로운 케이스 ID를 입력한 후 슬라이드 ID를 할당합니다.

bf라고 표시된 점을 클릭하십시오. 이것은 명시야(brightfield) 옵션입니다. 스캔 선택 항목에서 10 x pre-scan을 선택하십시오.

2, 500 x 원형, 10, 000 x 원형 또는 사각형을 선택하십시오. 설정(set)을 클릭하고 실행(run)하십시오. 그다음, 안내 메시지에 따라 스캐닝을 적절하게 조정하고 완료(finish)를 클릭하십시오.

스캔을 시작하려면 메인 탭을 눌러 메인 화면으로 돌아갑니다. 이제 오프라인 버튼을 클릭하고, 할당된 케이스 ID와 슬라이드 ID를 찾으십시오. 그런 다음 오프라인을 클릭하십시오.

왼쪽 상단 영역의 블랙 박스를 스캔하십시오. 화살표를 클릭하고 10 x pre-scan을 선택하십시오. 관심 있는 이미지를 찾은 후 화살표를 사용하여 스캔된 이미지들을 살펴보십시오.

대상 영역 중앙의 화면을 더블 클릭하고 snap을 누릅니다. 이렇게 하면 모든 대상을 선택한 후 나중에 캡처할 이미지를 지정할 수 있습니다. 각 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고, classify를 클릭한 다음 10 x pre-scan과 polytan을 선택합니다.

메인 메뉴로 돌아가 40 x 사전 스캔(pre-scan)을 설정하십시오. 다시 온라인을 선택하고 슬라이드를 선택하십시오. BF를 ffl로 변경하고 작업 이름을 revisit-X-40-rg로 변경하십시오.

마지막 설정 바로 아래의 섹션을 'revisit dash all'로 변경하십시오. 그다음 프로그램을 실행하고 안내 프롬프트를 따르십시오. 자동화를 설정하려면 'start matching views' 버튼을 클릭하여 10x 및 40x 이미지를 매칭하십시오.

'완료'를 클릭하여 스캔을 시작하십시오. 완료되면 '분류'를 클릭하여 이미지를 확인하십시오. 암컷 anomaly Gambia의 난소 간호세포 다가 염색체 표본은 고압법을 사용하여 제작되었습니다.

이 방법은 대부분의 염색체 구조를 손상시키거나 변화시키지 않습니다. 굽은 염색체를 펴줌으로써 일반적인 표본에서는 보이지 않는 숨겨진 미세 밴드들을 드러냅니다. 염색체는 S Gambia nd Tam BAC 라이브러리에서 얻은 BAC DNA 클론으로 프로빙되었습니다.

라이브러리는 anomaly S Gambia 해충 균주의 암수 1령 성상 유충(first instar larva)으로부터 생성되었습니다. 이 절차에 따라, 염색체 기반의 게놈 조립을 신속하게 개발하기 위해 자동화된 고처리량 물리적 매핑을 수행할 수 있습니다.