셀 침습적 DISC1 단백질 종의 생성, 정제 및 특성

다음 절차의 전반적인 목적은 정제된 disc를 생성하는 것입니다. 이는 수용 세포로 침투할 수 있는 응집체를 형성합니다. 첫 번째 방법을 통해 이 목표를 달성하기 위한 두 가지 서로 다른 방법이 시연될 것입니다.

some forming 형광 단백질 disc one 융합 단백질을 NLF 인간 신경모세포종 공여자 세포에서 과발현시킵니다. 그다음 세포를 PBS로 세척하고 수집하여 계면활성제 없이 용해합니다. DNA를 소화시키고 sucrose 구배 시스템을 사용하여 agro zone을 정제합니다.

이 방법으로 정제된 Agrios는 세포 침투 효율이 낮습니다. 대안적인 접근 방식은 재조합 disc one 단백질의 5 98에서 7 85까지의 아미노산을 e coli에서 과발현시키는 것입니다. 그 후 단백질 단편을 DITE 5 94로 표지하고 투석하며, 결합되지 않은 잔류 염료 및 다량체 disc를 제거하는 NI NTA 매트릭스를 사용하여 정제합니다.

이 방법으로 생성된 fragment는 숙주 세포 침투를 평가하기 위한 높은 세포 침투 효율을 갖습니다. 정제된 형광 단백질 disc, 리보솜 또는 표지된 재조합 disc를 사용합니다. fragment를 대상 수용 세포와 함께 배양합니다.

그 후 Trypan blue를 첨가하여 세포 외 형광을 소광시키고, 공초점 현미경으로 침습 정도를 시각화합니다. 지금까지 단백질 응집은 조현병과 같은 만성 정신 질환의 특징으로 인식되지 않았습니다. 조현병에서 파괴된 하나의 단백질이 후보이며, 단백질 응집체의 세포 침습성은 단백질 구조 질환의 핵심적인 특징입니다.

본 연구에서는 두 가지 방법을 통해 disc one 단백질 응집체가 세포 침투성을 가지며, 이에 따라 disc one 관련 질환 또는 disc one 신경병증이 단백질 구조 이상 질환임을 보여줍니다. 두 가지 방법은 첫째, 신경모세포종 세포주로부터 전체 길이의 disc one ASOS를 정제하는 것이며, 둘째, E. coli에서 C-말단 다량체 disc one 단편을 발현시킨 후 이를 정제하고 형광 염료로 표지하는 것입니다.

첫 번째 방법은 정제된 마이크로솜을 흡수한 세포의 약 0.3%만이 침투하는 낮은 효율을 보인 반면, 정제된 재조합 단백질 단편은 노출된 세포의 최대 20%까지 감염시켰습니다. 여기에 기술된 방법들은 아크로솜 형성 또는 다량체 조립이 입증된 다른 단백질에도 적용 가능할 것입니다. 10 cm 디시 10개 각각에서.

보충제가 첨가된 RPMI 1640 배지에 1.5 × 10⁶개의 인간 신경모세포종 및 LF 세포를 분주하고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 세포의 합류도가 70~80%가 되어야 합니다. 5개의 디쉬에는 PC DNA 3.1 MRFP 및 EGFP가 태깅된 인간 full-length disc 1을 형질전환하기 위해 표시하고, 나머지 5개의 디쉬에는 EGFP 플라스미드만 형질전환하기 위해 표시합니다. 각 10 cm 디쉬당 15 µg의 플라스미드 DNA, 30 µL의 met affecting 및 750 µL를 혼합합니다.

마이크로 원심분리 튜브에 Opti MEM을 넣고 피펫팅으로 섞어준 뒤, 상온에서 20분 동안 배양합니다. 그 다음 세포에 형질전환시키기 위해 DNA 형질전환 시약 용액을 세포에 한 방울씩 첨가하고, 37°C, 5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 배양합니다. 형질전환 후 mRFP full length disc 1의 발현을 모니터링하고 형광 현미경 하에서 aggresome의 형성을 확인합니다. 여기에서 보는 바와 같이 일부 세포에는 거대한 형광 단백질 응집체가 존재합니다.

본 프로토콜은 뇌 조직에서 루이 소체(Lewy bodies)를 정제하는 방법과 더 큰 응집체 또는 agro zone을 분리하는 프로토콜을 결합한 것입니다. 기존의 방법들은 세제(detergent) 사용을 기반으로 하므로, 세포 침습성 분석(cell invasiveness assays)에 적용하기 위해 세제가 없는 단백질을 분리하는 것이 매우 중요합니다. 다음으로, 배지를 흡입하여 제거하고 PBS로 세척한 후, 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)이 포함된 PBS 400 µL를 첨가합니다. 그런 다음 세포를 긁어 모아 세포 현탁액 1 mL와 세라믹 비드 10개를 2 mL 용해 튜브(lysis tube)에 넣습니다.

pre-cell lyse 24 균질기를 사용하여 62nd 펄스로 3회 세포를 용해합니다. 이 과정의 기계적 힘으로 인해 샘플 내부 온도가 37 °C 이상으로 상승할 수 있으므로, 샘플을 얼음 위에서 냉각시키는 데 주의를 기울여야 합니다. 용해 절차 후, 세포를 얼음 위에서 냉각시킨 다음 10 mM magnesium chloride와 40 units/mL DNAA를 첨가하고 37 °C에서 60분 동안 흔들어주며 배양합니다.

PBS에서 80%, 50%, 20% 농도의 설탕(sucrose) 용액(w/v)을 각각 10밀리리터씩 준비합니다. 그 다음 15밀리리터 원심분리관(conical tube)에 80% 설탕 용액 2밀리리터를 먼저 넣고, 이어서 50% 설탕 용액 2밀리리터와 20% 설탕 용액 2밀리리터를 순차적으로 넣어 설탕 농도 구배(sucrose gradient)를 형성합니다. 이때 이미 부어놓은 층이 섞이지 않도록 천천히 붓습니다.

소화된 용해물을 농도 구배 위에 층을 이루게 얹고 4°C에서 1000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 원심분리기를 멈춘 후, 피펫을 사용하여 50~80% sucrose 층 사이의 계면을 조심스럽게 수집하고, 15 mL 원추형 튜브에 5배 부피와 섞어 4°C에서 1000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿이 포함된 agrisome 층을 유지합니다.

이 인터페이스에서 세척 과정을 두 번 더 반복합니다. Agri zone은 형광성을 띠므로 마지막 세척 후 UV 광원 하의 현미경으로 시각화할 수 있으며, 상층액을 제거하고 펠렛을 250에서 500 µL의 PBS에 재현탁합니다. 이 펠렛에는 정제된 agro zone이 포함되어 있습니다.

SH SY5Y 인간 신경모세포종 세포가 담긴 24웰 플레이트의 각 웰에 MRFP disc 1 아좀 현탁액 10 µL를 첨가합니다. 멸균 유리 커버 슬립 상에서 가용성 GFP disc 1 C-말단을 상시 발현시키고 48~72시간 동안 배양합니다. 배양 후 세포를 PBS로 3회 세척하고, 0.04% trypan blue로 5분 동안 세포 외 형광을 소광합니다.

그 후 PBS로 세척하여 트라이판 블루(trian blue)를 제거합니다. 다음으로, 디쉬를 얼음 위에 놓고 4% PFA와 PBS를 첨가하여 10분 동안 세포를 고정합니다. 그런 다음 멸균수로 한 번 세척하고, DPI 마운팅 용액이 포함된 prolonged gold를 사용하여 커버슬립을 유리 슬라이드에 마운팅합니다.

Z-stack 이미지에서 수용 세포에 의해 발현된 모집 단백질과의 공국소화를 통해, 외인성으로 적용된 aggro zone의 침입 및 섭취를 확인합니다. 이 Z-stack은 약 6 µm의 깊이를 포함합니다.

200 nanometers 간격으로 촬영된 24장의 사진입니다. 빨간색으로 표시된 MRFP disc one agri zone의 형광이 세포질의 GFPC terminal disc fragment를 모집합니다. 녹색으로 표시된 부분의 공동 국소화(colocalization)는 노란색으로 나타나며, 이는 agri zone이 수용 세포질로 진입하여 이전에 가용성 상태였던 disc one 단백질을 모집했음을 나타냅니다.

프로토콜의 이 단계에서는 human disc one을 DITE 5 94로 표지합니다. 이 D는 추가적인 면역 염색 없이도 재조합 단백질을 직접 모니터링할 수 있게 해줍니다. 먼저, 동봉된 문서에 기술된 대로 준비된 단백질을 1:2000 희석된 2L의 PBS에서 3회 투석하여 beam mercaptoethanol을 제거하십시오.

1 mg의 disc 1을 DITE 5 94 IDE로 라벨링하십시오. 1 mg/mL 농도의 단백질을 PBS에 녹인 후, 자유 TH 그룹을 회복시키기 위해 5 mM TCEP를 첨가하십시오. DMF에 녹인 염료 20 µL를 반응물에 넣고 상온에서 2시간 동안 인큐베이션하십시오. 분자량 컷오프가 10,000 Daltons인 SLI 투석 카세트를 사용하여, PBS에서 1:2000 비율로 2시간씩 3회 단백질을 투석하십시오. 다음으로 라벨링된 단백질의 순도를 더욱 높이십시오.

Ni-NTA 컬럼을 이용한 His-tag 기반 친화성 정제를 수행합니다. 1 mL의 Ni-NTA 매트릭스를 10 mL의 PBS로 세척한 후, 라벨링 및 투석 과정을 거친 단백질을 컬럼에 로딩하여 통과시킵니다.

단백질이 NTA 매트릭스에 결합함에 따라 용액의 푸른색이 서서히 옅어지며, 라벨링되지 않은 유리 염료는 통과액에 남아 있게 됩니다. 단백질 용액이 컬럼에 주입되면, 20 mL의 PBS로 컬럼을 3회 세척하십시오. 단백질을 용출시키기 위해 500 mM imidazole이 포함된 PBS 2 mL를 컬럼에 첨가하십시오.

밸브를 저속으로 설정하고 Ni-NTA 컬럼의 유색 밴드를 모니터링하면서 한 방울씩 용리합니다. 용리액의 이 유색 분획에는 표지된 재조합 단백질이 포함되어 있습니다. 용리액(EIT)을 SLI 투석 카세트로 옮기고, 2L의 10 mM NaPi 용액에 1:2000 비율로 희석하여 2시간씩 총 3회 투석합니다. 투석 후, 용리액(EIT)을 멸균된 0.45 µm 시린지 필터로 여과한 다음, 100 µL씩 5개의 샘플로 분주하여 액체 질소로 급속 냉동합니다.

각 100 µL 분주액당 총 단백질 양은 0.5에서 1 µg/mL가 되어야 합니다. 단백질의 침습성을 평가하려면 수용 세포인 SH SY 5Y 인간 신경아세포종 세포가 포함된 24웰 플레이트의 각 웰에 5~10 µg/mL의 표지된 재조합 Disc1 단백질이 포함된 배지를 첨가하십시오. 수용성 GFP 태그가 부착된 Disc1 C-말단이 지속적으로 발현되는 멸균 유리 커버슬립 위에서 48~72시간 동안 배양하십시오.

세포 외 형광을 소광하고 agri zone 처리 세포와 동일한 방식으로 세포를 고정 및 마운트한 후, Z-stack 이미징을 통해 외생적으로 투여된 재조합 단백질의 침투를 확인합니다. 라벨링된 단백질이 흡수되면, 공초점 현미경으로 생성된 이미지에서 수용 세포의 경계 내에서 검출됩니다. 이 Z-stack은 220 nm 간격의 24단계로 약 5 µm의 깊이를 포함합니다.

여기서 빨간색으로 표시된 재조합 disc one 단편 5 98 to 7 85가 녹색으로 표시된 가용성 C-말단 GFP 태그 disc one을 발현하는 수용 세포에 의해 섭취되어, disc one 단백질 응집체의 침투성을 결정합니다. MRFP 태그가 붙은 전장 disc one으로 구성된 agro zone은 NLF 세포에서 정제되었으며, 이 프로토콜에 설명된 대로 수용 SH SY five Y 세포에 적용되었습니다. 여기에서 보는 바와 같이, A-M-R-F-P 태그 disc one acrosome이 가용성 GFP 태그 C-말단 disc one을 발현하는 인간 신경모세포종 SH SY five Y 세포로 침투하였습니다.

또한, MRFP 태그가 붙은 disc one asome은 용해성 GFP 태그 disc one을 불용성 응집체로 끌어들일 수 있었습니다. DIA light로 표지된 재조합 disc one의 침습성을 결정하기 위해, 여기에서 보는 바와 같이 용해성 GFP disc one을 발현하는 SH SY five Y 신경모세포종 세포에 이를 처리하였습니다. 빨간색으로 표시된 재조합 disc one 단백질 말터가 수용 세포로 침습하였습니다. 노란색 점은 용해성 GFP 태그 C-말단 disc one이 응집체로 끌어들여진 것을 나타냅니다. E. coli에서 발현 및 정제된 표지 재조합 disc one 또한 다량체 단백질을 쥐의 내측 전전두엽 피질에 입체 정위 주입했을 때 생체 내 뉴런에 대해 세포 침습성을 보였습니다. Z-stack 이미징을 통해 뉴런 핵 항체로 염색된 쥐의 피질 뉴런 내에 재조합 disc one 단백질이 존재함을 확인하였습니다.

우리는 세포 침습 연구를 위한 disc one 응집체를 생성하는 두 가지 방법을 보여드렸습니다. 이 두 가지 방법 중 어느 것을 사용하더라도, 외래 DNA의 형질전환을 통한 재조합 유전자 발현이라는 잠재적인 혼란 변수 없이 disc one 응집체 섭취의 세포적 영향을 조사할 수 있습니다. 이러한 기술은 세포 내 in vitro 실험에서의 disc one 단백질 병증의 생물학적 영향을 조사하거나, 동물 모델에서의 뇌내 접종 또는 기타 투여를 통한 in vivo 실험에 적용될 수 있습니다.

우리는 각 특정 단백질에 맞게 프로토콜을 약간 수정한다면, 이러한 기술들이 결과적으로 다른 단백질 응집체에도 적용될 수 있을 것이라고 확신합니다. 이 절차를 수행할 때, 공초점 현미경 이미지의 면밀한 분석을 위해 충분한 시간을 할애하십시오.