특정 엔도와 exoglycosidases를 사용하여 단백질 글리코 실화의 식별 및 특성

다음 실험의 전반적인 목표는 모델 당단백질의 n 및 O 결합 당쇄화에 대한 효소적 탈당쇄화 및 분석을 위해 glycosate를 사용하는 방법을 설명하는 것입니다. 이는 당단백질을 PGA's F 또는 단백질 탈당쇄화 믹스로 처리함으로써 달성됩니다. 또한, 단백질 탈당쇄화 믹스에는 때때로 제거하기 어려운 당을 제거하는 데 도움이 되는 추가적인 엑소 글리코 효소 혼합물이 보충되었습니다.

우리는 모델 당단백질인 재조합 인간 황체형성호르몬 베타(recombinant human chorionic gonadotropin beta, HCG beta)를 사용하여 이 방법을 설명합니다. 먼저 SDS page를 실시한 후, Coomassie blue 염색과 당 특이적 염색법을 수행합니다. 당쇄화(D glycosylated) 분석을 위해 Pro Q Emerald 300을 사용합니다. HCG beta 샘플 분석 결과, 당쇄 처리 유무에 따른 단백질 이동 속도의 차이와 당쇄가 순차적으로 제거됨에 따라 ProQ 염색 신호가 감소하는 것을 통해 HCG beta가 불균일하게 당쇄화되어 있으며 여러 당쇄 형태(glyco forms)를 포함하고 있음을 알 수 있습니다.

질량 분석법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 간단하고 일반적인 실험실 장비를 사용하며, 초보 당생물학자에게 적합하다는 것입니다. 이 방법은 내 단백질이 당화되었는가와 같이 당생물학 분야의 핵심 질문에 답을 줄 수 있습니다. 효소적 탈당화(enzymatic deglycosylation)를 시작하려면 단백질 탈당화 키트(protein deglycosylation kit)에 포함된 버퍼를 해동하십시오.

튜브를 충분히 혼합하고 상온에서 보관하십시오. 효소가 포함된 바이알을 얼음 위에 놓고, HCG beta 바이알의 내용물을 600 µL의 증류수에 녹여 얼음 위에 보관하십시오. 10x 스톡을 증류수로 희석하여 1XG seven 버퍼 1 mL를 준비한 후, 25 µL를 사용하여 0.5 µL의 PGA's f를 희석하십시오.

네 가지 exo glyco diseases를 각각 2µL씩 혼합하여 exo glycosate 믹스를 준비합니다. 다음으로, 서면 프로토콜에 명시된 대로 번호가 매겨진 7개의 PCR 튜브에 HCG beta와 10x glycoprotein 변성 버퍼를 넣고, 튜브 캡을 닫고 가볍게 섞어줍니다. 써모사이클러에서 94°C로 10분간 인큐베이션한 후 4°C에서 유지하여 단백질을 변성시킵니다. 써모사이클러에서 튜브를 꺼낸 후, 원심분리를 통해 각 반응 튜브의 가시적인 응결물을 제거합니다. 서면 프로토콜에 따라 나머지 시약들을 추가합니다. 새 캡을 사용하여 PCR 튜브를 닫습니다.

그 다음, 원심분리를 통해 내용물을 가라앉힌 후 튜브를 가볍게 네 번 두드려 섞어주고, 튜브를 써모사이클러(thermocycler)에 넣어 37 °C에서 4시간 동안 배양합니다. 이어서 샘플을 4 °C로 냉각합니다. SDS-PAGE를 준비하기 위해, 신선한 3x 환원 SDS 로딩 버퍼를 제조합니다.

DTT가 포함된 준비된 3배 농축 환원 SDS 로딩 버퍼 12.5 µL를 각 샘플에 추가하고, 새 캡으로 튜브를 닫은 후 가볍게 두드려 섞습니다. 서모사이클러를 사용하여 94 °C에서 5분 동안 배양한 후, 4 °C로 냉각합니다. 배양 후, 각 샘플 30 µL와 단백질 마커 10 µL를 10-20% tri-glycine 젤에 로딩합니다. 각 샘플의 잔량은 보관합니다.

D 전선이 젤 바닥 근처에 도달할 때까지 130V에서 젤 전기영동을 수행합니다. 전기영동이 완료되면 캐스트에서 젤을 꺼내어 젤이 충분히 잠길 정도의 쿠마시 블루 염색액이 담긴 작은 플라스틱 상자에 넣습니다. 부드럽게 흔들어주며 1시간 동안 젤을 염색합니다.

30분 동안 3회 세척합니다. 50 mL의 염색 제거 용액(detain solution) 내에서 화이트 라이트 트랜스루미네이터 또는 스캐너를 사용하여 이미지를 기록합니다. 또는, 셀로판 시트 사이에 겔을 넣어 건조시킬 수도 있습니다.

각 샘플의 잔여물과 단백질 마커를 10~20% Tri glycine 겔에 로딩하여 전기영동을 수행합니다. 겔이 실행되는 동안 DMF로 ProQ emerald 시약을 용해하고, 키트에 제공된 제품 매뉴얼에 따라 염색을 위한 고정액, 세척액 및 산화액 스톡 용액을 준비합니다. 전기영동이 완료되면 캐스트에서 겔을 분리하여 플라스틱 박스에 넣습니다.

준비된 고정액 100 milliliters를 첨가하여 겔을 고정합니다. 겔을 상온에서 하룻밤 동안 두고, 다음 날 부드럽게 흔들어 줍니다. 준비된 세척액 100 milliliters를 사용하여 상온에서 10분에서 20분 동안 부드럽게 흔들며 겔을 세척하고, 새 세척액으로 세척 과정을 한 번 더 반복합니다.

다음으로, 준비된 산화 용액 25 milliliters 내에서 젤을 부드럽게 흔들어 30분 동안 배양하여 탄수화물을 산화시키고, 배양 후 젤을 세척하는 동안 두 번 더 추가로 세척합니다. 키트에 제공된 염색 완충액 25 milliliters에 ProQ Emerald 300 시약 용액 500 microliters를 더해 신선한 ProQ emerald 300 염색액을 준비합니다. 젤 염색 후, 준비된 염색액 내에서 암소 상태로 부드럽게 흔들어 90분에서 120분 동안 배양하여 젤을 염색합니다.

앞서 설명한 두 단계의 세척 과정을 반복합니다. 그런 다음 300 nanometers의 UV 투과 조명기(trans illuminator)로 이미지를 기록합니다. 마지막 단계로, kumasi 염색 젤의 이미지와 ProQ emerald 염색 젤의 이미지를 비교합니다.

대조군 샘플을 PGA의 F 처리군과 비교하면 효소적 탈당화 후 단백질 이동도의 변화를 확인할 수 있습니다. n-글리칸을 제거하기 위한 처리와 n- 및 O-글리칸을 모두 제거하기 위한 탈당화 혼합물(Deglycosylation mix) 처리를 수행했을 때, 추가적인 글리코사이드 분해 후에는 더 이상의 크기 감소가 관찰되지 않습니다. 질량의 변화 외에도, 글리칸이 제거됨에 따라 밴드가 더 선명해집니다.

17 kilodalton 마커 아래로 나타나는 밴드는 완전히 탈당쇄화된 HCG beta 폴리펩타이드일 가능성이 높습니다. 5번에서 7번 레인은 Glyco에 해당하는 밴드들을 보여줍니다. 그 외의 밴드들은 불완전한 탈당쇄화 또는 HCG beta 샘플에 존재하는 확인되지 않은 여러 단백질로 인해 발생했을 수 있습니다.

에메랄드 그린 시약은 단백질 분자에 존재하는 모든 글리칸을 산화시키고 염색합니다. 따라서 HCG beta가 효소적으로 탈글리코실화됨에 따라 신호 강도는 감소합니다. 3번 및 4번 레인에 남아 있는 신호는 사용된 효소에 저항성을 갖는 글리칸 모티프가 존재함을 나타냅니다.

추가적인 glycosate가 4번 레인에서 사용되었습니다. 당 잔기를 몇 개 더 제거합니다. 단백질 이동도는 동일하지만, 염색 강도가 약간 감소한 것을 확인할 수 있습니다.

모든 단백질 종에서 저항성 당 잔기가 나타난 것은 아니었습니다. 일부 밴드는 emerald Green으로 검출되지 않았으며, 이는 해당 단백질들이 광범위하게 탈당쇄화되었음을 나타냅니다. 추가 데이터는 HCG beta가 불균일하게 당쇄화되어 있다는 결론을 뒷받침합니다. 2번 레인의 아래쪽 밴드는 emerald green 이미지에서 희미하게 보입니다.

2번 레인의 상단 밴드가 밝게 나타나는 것은 많은 GLYCAN 그룹이 여전히 존재함을 나타내지만, 이 데이터는 마우스 세포에서 발현된 재조합 HCG beta가 당화의 내재적 불균일성으로 인해 여러 당쇄 형태를 포함하고 있다는 결론을 뒷받침합니다. 이 절차 이후에, 점유율은 어느 정도인가? 당화의 범위는 어느 정도인가, 또는 당쇄의 미세 구조는 무엇인가?와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 질량 분석법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 당단백질의 N-연결 글리칸에 대한 효소적 탈당쇄화 및 분석을 위해 glycosylate를 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 단백질 염색 영역은 탈당쇄화 결과로 분자량의 유의미한 변화가 나타나는 단백질에만 유용하므로, 검출 방법의 선택이 어려울 수 있습니다.

탈당쇄화 후 비정상적인 이동을 확인했으며, 이동의 모든 변화는 단백질이 탈당쇄화되었다는 증거임을 발견했습니다.