야생 유충에서 Hemocytes을 추출하기위한 간단한 프로토콜

이 실험 절차의 전반적인 목표는 야생 나비 애벌레로부터 혈구(hemocytes)를 추출하고 시각화하여 그 수를 세는 것입니다. 이를 위해 먼저 애벌레를 얼음 위에 올려 마취시킨 후, 항응고제가 포함된 완충 용액을 주입하고 다시 얼음 위에 두어 추출 전 혈구가 혈액 순환계로 다시 진입하도록 합니다. 두 번째 단계는 깨끗한 메스를 사용하여 애벌레의 후단부에 얕은 절개를 만드는 것입니다.

다음으로, 부드러운 핀셋을 사용하여 애벌레를 조심스럽게 짭니다. 그런 다음 마이크로 피펫을 사용하여 버퍼 용액과 혈림프 혼합액을 흡입하여 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다. 마지막 단계로 혈림프 용액을 동일한 부피의 버퍼 용액과 부드럽게 섞은 후, 용액 10 µL를 혈구계(hemo cytometer)에 옮겨 혈구(he cytes)의 수를 시각화하고 측정합니다.

궁극적으로, 이 혈구 추출법은 다양한 나비목 유충 종의 혈구 수를 측정하는 빠르고 효과적인 방법으로 활용될 수 있으며, 곤충의 세포성 면역 반응의 생리학적 측면을 조사하는 도구로 보존될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전흉부(prothorax)가 매우 축소된 유충에서도 혈구(hemocytes)를 추출하는 데 사용할 수 있다는 점입니다. 다른 유충 모델의 경우, 전흉부 중 하나를 절단하여 출혈을 유도한 후 흘러나오는 액체에서 혈구를 추출합니다.

또한, 이 기술은 다른 곤충 종으로부터 혈세포를 추출하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 식단 품질, 발달 단계 또는 다양한 병원체 노출에 따라 곤충의 세포성 면역 반응이 어떻게 변화하는지와 같이 생태 면역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 활용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 혈세포 추출 전 20분 동안 얼음 위에 올려 냉각시켜 끝에서 두 번째 령(penultimate instar)의 유충을 마취시키십시오.

그 후, 깨끗한 16 gauge 모세관 바늘의 뭉툭한 끝부분을 20 milliliter 유리 주사기에 연결된 튜브에 끼웁니다. 수집 용액이 들어 있는 튜브는 실험대 위에 열어 둡니다. 모세관에 약 10 to 15 microliters의 완충액을 천천히 채웁니다.

그런 다음 해부 현미경 옆에 놓인 찰흙 뭉치 위에 바늘을 올려둡니다. 애벌레를 페트리 접시에 넣습니다. 구형 구조물들이 명확하게 보일 수 있도록 곤충을 옆으로 눕혀 배치해야 합니다.

해부 현미경으로 관찰하면서 핀셋으로 애벌레를 고정하고, 곤충의 큐티클이 일반적으로 더 부드러운 구형 마디 중 하나에 바늘을 가까이 댑니다. 그런 다음 모세관 바늘을 곤충의 몸체에 대고 부드럽게 누릅니다. 바늘이 큐티클을 관통하면 용액 전량을 애벌레에게 주입합니다.

주입 후 애벌레의 몸이 부풀어 오르겠으나, 터지거나 액체가 새어 나오지 않아야 합니다. 애벌레를 얼음이 담긴 페트리 접시로 옮기십시오. 완충액이 상처 부위로 새어 나가는 것을 방지하기 위해 곤충의 등 쪽이 위로 향하게 배치하십시오.

hemo limp 추출에 사용된 각 애벌레에 대해 주입 과정을 반복합니다. 그 다음 모든 곤충을 얼음 위에서 30분 동안 냉각시킵니다. 이제 애벌레를 해부 현미경 아래의 페트리 접시에 놓습니다.

멸균된 메스를 사용하여 장이나 다른 내부 기관이 손상되지 않도록 주의하며 애벌레의 후방 부위에 약 2~3 mm 길이의 얕은 절개를 가합니다. 그다음, 유연한 플라스틱 핀셋으로 애벌레를 부드럽게 짜내면서 10 µL 피펫 팁을 사용하여 혈림프 혼합물을 약 10~20 µL 수집합니다. 이때 내부 조직이 손상되지 않도록 다시 한번 주의하십시오.

그 후, 애벌레의 잔해를 폐기하십시오. 각 애벌레로부터 채취한 혈림프를 라벨이 부착된 개별 실리콘 처리된 0.5 milliliter 미세 원심분리 튜브에 수집하십시오. 그런 다음, 개별 애벌레에서 수집한 각 혈림프 샘플에 배양액 약 10 to 20 microliters를 첨가하십시오.

이 단계에서는 혈림프 샘플을 항상 얼음 위에 보관하십시오. 혈구 수(hemocytes)를 측정하기 직전에 혈림프 샘플과 배양액을 혼합하십시오.

이 처리는 혈구의 적절한 분리를 가능하게 하고 응집을 방지합니다. 깨끗한 피펫 팁을 사용하여 배양액과 혼합된 혈림프 샘플 10 µL를 혈구계수기에 옮깁니다. 그다음 복합 현미경을 사용하여 혈구계수기 중앙 격자의 큰 정사각형 최소 15개에 있는 혈구 수를 세어 기록합니다.

이 값들을 더하여 15개 구역에 있는 혈구 세포 수의 총합을 구합니다. 다음으로, 증류수 및 탈이온수가 들어 있는 세척병을 사용하여 혈구계수기(hemocytometer)와 커버 슬라이드를 철저히 헹굽니다. 그런 다음 Kim wipes로 닦아 건조시킵니다.

나머지 혈림프 샘플에 대해 동일한 절차를 반복하고, 각 애벌레의 혈림프 부피 1mL당 평균 혈구 수를 계산합니다. 명시야 현미경 이미지는 20배 배율에서 관찰한 nucle hin ai 애벌레로부터 추출된 혈구를 보여줍니다. 이 절차를 통해 수집된 혈구는 세포성 면역 반응을 연구하거나 식세포 작용, 캡슐화 및 pH 산화효소 활성과 같은 분석법을 설정하는 데 사용할 수 있습니다.

또한, 곤충의 이러한 세포성 면역 반응을 연구하기 위해 사용하지 않은 RNA, DNA 및 단백질을 추가 분석용으로 수집할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 혈림프 추출을 목적으로 애벌레에 주사하는 방법과 살아있는 혈구 세포가 포함된 혈림프를 수집하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.