의 야생 - 타입과 장식 품종을 구별하기 PCR 기반 Genotyping 방법 Imperata cylindrica

본 절차의 주된 목적은 형태학적 특징만으로는 구별할 수 없는 gon grass라고 불리는 Retta cylindrica의 품종들을 구분할 수 있는 비용 효율적이고 신속한 분자 유전형 분석 프로토콜을 제공하는 것입니다. 이는 먼저 관심 대상인 gon grass 품종의 조직을 식별하고 분리함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 수집된 조직에서 핵 DNA와 플라스티드 DNA를 추출하는 것입니다.

다음으로, PLAs turn LF 영역의 서열 차이를 표적으로 하는 품종 특이적 프라이머와 적절한 양성 및 음성 대조군을 사용하여 추출된 DNA에 대해 중합효소 연쇄 반응을 수행합니다. 마지막 단계는 4가지 PCR 반응 각각에 대해 젤 전기영동을 수행하여 증폭된 PCR 생성물을 시각화하는 것입니다. 최종적으로, 젤에 나타난 품종 특이적 PCR 생성물 밴드 분석을 통해 수집된 곤그라스의 품종을 결정합니다. 외래 침입 식물은 미국에 연간 약 34억 달러의 비용을 발생시키며, 농업 및 천연자원 모두에 상당한 피해를 줍니다.

Cogan grass로도 알려진 야생형 Imperata cylindrica는 세계 10대 최악의 침입성 잡초 중 하나입니다. Cogan grass는 토착 식생을 대체하는 단일 군락을 형성하여 빠르게 확산하며, 결과적으로 해당 토착 식생에 의존하는 동물들에게 영향을 미칩니다. 현재 이 잡초는 전 세계적으로 4억 9천만 헥타르, 미국 내에서는 약 50만 헥타르에 걸쳐 분포하고 있습니다. 또한, Imperata cylindrica의 관상용 품종은 Imperata cylindrica, Arbra, red Baren, 그리고 Japanese blood grass(이하 JBG로 지칭)라는 이름으로 널리 판매되고 있습니다. 이 품종은 추정상 불임이며 침입성이 없는 것으로 알려져 있으며, 붉은색 잎으로 인해 가치가 높다고 여겨집니다.

특정 조건 하에서, 일본혈초(Japanese blood grass)는 생존 가능한 종자를 생성할 수 있으며, 야생형 코간그라스(cogan grass)와 구별할 수 없는 전체 녹색 형태로 회귀할 수 있습니다. 보시는 바와 같이, 두 형태 모두 녹색 잎을 가지고 있으며, 전통적인 관상용 품종보다 잎이 더 크고 크기도 더 큽니다. 또한, 회귀형 및 야생형 식물은 근경이 더 크며, 이는 관상용 품종의 무성 생식 잠재력을 증가시킵니다.

형질 환원으로 인해 형태학만으로는 식별이 어렵습니다. 이는 매우 까다로운 작업입니다. 분자 생물학적 방법은 일반적인 시각적 수단으로는 식별할 수 없는 침입 식물 및 식물 재료를 정확하게 구별할 수 있는 수단을 제공합니다.

분자 생물학적 방법은 외래 침입 식물의 확산과 유입을 방지하는 데 매우 중요합니다. 본 분자 프로토콜을 적용하면 일본혈초(Japanese blood grass)의 회귀 변이체와 코간그라스(Kogan grass)를 정확하게 구별할 수 있습니다. 이 프로토콜은 코간그라스와의 공존 및 생존 가능한 잡종의 형성 가능성을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다.

증폭 단편 길이 다형성(amplified fragment length polymorphism) 또는 AFLP 분석, DNA 시퀀싱과 같은 기존 기술과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 야생형 kogan grass와 Japanese blood grass의 여러 품종 간의 차이를 쉽게 구별할 수 있는 매우 비용 효율적이고 신속한 분자 유전형 분석 기술을 제공한다는 점입니다. 이 기술의 시연은 저희 실험실의 학부생인 Joseph Hery가 맡겠습니다. 먼저 kogan grass 또는 Japanese blood grass가 자라고 있어 서로 구별이 필요한 지역에서 표본을 확인하십시오.

일본혈초(Japanese blood grass)는 밝은 빨간색 잎으로 인해 야생형 코간초(Kogan grass)와 쉽게 구별됩니다. 그러나 일본혈초의 회귀변이체(revert)는 관상용 일본혈초보다 잎이 더 길고 초록색이며, 엽면적이 더 넓고 근경이 더 크기 때문에 코간초와 거의 구별되지 않습니다. 이 방법은 신선한 상태, 냉동 상태 및 최근에 건조된 잎 조직에 모두 적용할 수 있습니다.

나중에 DNA 추출을 위해 조직을 보관해야 하는 경우, 가장 좋은 방법은 조직을 즉시 -80°C에서 냉동 보관하는 것입니다. 건식 보관이 필요한 경우에는 조직을 종이 봉투에 넣고, 해당 봉투를 실온에서 탈수된 실리카겔 또는 다른 활성 건조제와 함께 보관하십시오. 신선한 조직을 사용하는 경우, 분해를 방지하기 위해 수집 후 3시간 이내에 DNA를 추출하시기 바랍니다.

본 절차는 제조사의 지침에 따라 Kyogen의 DNEZ plants mini kit를 사용하며, 한 가지 사소한 수정 사항이 있습니다. 여기에서 본 절차는 100 mg 이상의 신선 또는 냉동 조직이나 20 mg 이상의 건조 조직을 사용하도록 조정되었습니다. 먼저 냉각된 막자사발을 사용하여 액체 질소를 세 차례 투입하며 100 mg 이상의 신선 또는 냉동 잎 조직, 또는 20 mg 이상의 건조 잎 조직을 미세한 분말로 갈아줍니다.

신선하거나 냉동된 조직에서 얻은 냉동 분말을 100 mg씩 분주하여 무게를 잽니다. 건조 잎 조직을 사용하는 경우에는 분말을 20 mg씩 분주하여 무게를 잽니다. 이 단계 이후, 제조사의 지침에 따라 DNA 추출을 진행하며 NanoDrop 분광광도계와 같은 분광광도계를 사용하여 DNA의 품질과 양을 테스트합니다. 양질의 DNA 수율은 µL당 50~150 ng 사이여야 하며, 260/280 및 230/280 비율은 여기에서 보이는 것과 같이 2.0에 가까워야 합니다.

표준 1% AROS 겔을 사용하여 전기영동을 수행합니다. 10 KB보다 큰 상대적으로 큰 밴드들이 존재하는지 확인하십시오. DNA 농도가 높을 경우 RNA 오염으로 인한 스트리킹(streaking)이 거의 없거나 전혀 없어야 하며, 이후 단계를 위해 시료를 70 nanograms per microliter로 희석하십시오. 빨간색과 초록색 화살표로 표시된 본 프로토콜의 PCR 프라이머는 Cogan grass와 Japanese blood grass 유전자형의 plastered turn LF 스페이서 영역 간의 서열 차이를 기반으로 합니다.

이러한 차이는 수직 검은색 화살표로 표시된 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphisms)과 삽입 및 결실의 형태로 나타나며, 이를 통해 품종 특이적 프라이머를 개발할 수 있습니다. 프라이머를 고유 서열 부위에 배치함으로써, 프라이머 서열은 프로토콜의 서면 부분에 포함되어 있습니다. 각 분리된 DNA 샘플에 대해 서면 프로토콜에 따라 각 프라이머 세트를 사용하여 0.2 milliliter 박벽 PCR 튜브에 50 microliter PCR 반응액 2개를 얼음 위에서 준비합니다. DNA 농도가 낮은 경우, 전체 반응 부피가 50 microliter로 유지되도록 핵산 분해 효소가 제거된 이중 증류수의 양을 조절하면서 각 반응에 DNA를 더 추가할 수 있습니다.

DNA 샘플에 포함된 불순물이 PCR 반응을 억제할 수 있으므로, 반응당 DNA 사용량은 5 µL 또는 전체 부피의 10%를 초과하지 않도록 합니다. 모든 PCR 시약이 정상적으로 작동하는지 확인하기 위해 양성 대조군(positive control)을 설정하십시오. 양성 대조군과 동일한 프라이머 세트를 사용하되, 추출된 DNA 대신 2중 증류수를 넣어 음성 대조군(negative control)을 설정합니다. 이 시점에서 각 테스트 샘플당 총 4개의 PCR 반응이 구성됩니다. 다음으로, 가열 뚜껑이 장착된 서모사이클러(thermocycler)를 사용하여 서면 프로토콜에 명시된 PCR 사이클 매개변수에 따라 PCR 증폭을 수행하십시오. DNA, 프라이머, Taq polymerase의 품질이나 사용된 서모사이클러의 종류에 따라 프라이머 어닐링 온도, 신장 시간 및 사이클 횟수에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다.

PCR 반응이 완료되면, 표준 전기영동법을 사용하여 1% 겔에서 PCR 생성물을 분리하십시오. DNA 전선이 겔 전체 길이의 4분의 3 지점에 도달할 때까지 약 120V에서 샘플을 전기영동합니다. UV 광원 아래에서 겔을 시각화하고, 생성된 밴드를 검사하여 적절한 DNA 단편이 증폭되었는지 확인하십시오.

이 대표 젤 이미지는 Kogan grass, Japanese blood grass, 그리고 Japanese blood grass revert DNA 샘플을 Kogan grass 및 JBG 특이적 프라이머와 결합하여 PCR을 수행한 결과와 turn LF 양성 대조군 및 템플릿 미첨가 음성 대조군의 전기영동 결과를 보여줍니다. turn LF 양성 대조군 프라이머 세트는 Cogan grass, Japanese blood grass, Japanese blood grass revert 및 기타 grass류에 대해 동일하게 잘 작동하며, 890 base pairs 크기의 밴드를 형성합니다. 모든 PCR 시약에 DNA 오염 물질이 없다면, 음성 대조군 반응에서는 PCR 산물이 생성되지 않습니다.

DNA 샘플이 야생형 kogan grass에서 유래한 경우, Kogan grass 특이적 프라이머 세트를 사용한 PCR 반응은 약 595 base pairs에서 단일 밴드를 형성하며, JBG 특이적 프라이머는 밴드를 형성하지 않습니다. 마찬가지로, DNA 샘플이 JBG 또는 복구된 J-B-G-A-P-C-R 반응에서 유래한 경우, JBG 특이적 프라이머 세트를 사용하면 약 594 base pairs에서 단일 밴드가 나타납니다. 반면 Kogan grass 특이적 프라이머는 밴드를 형성하지 않습니다.

JBG와 회귀된 JBG는 핵산 서열이 동일하므로 밴딩 패턴 또한 동일하게 나타납니다. 하지만 JBG와 JBG 회귀체 사이의 형태학적 차이는 상당히 뚜렷하므로, PCR 결과는 동일하더라도 식물 수준에서 JBG 품종들을 쉽게 구분할 수 있습니다. PCR 생성물의 DNA 시퀀싱을 통해 서로 다른 코간 그라스 생태형의 DNA 서열 변화 가능성을 확인할 수 있습니다.

본 기술의 개발은 야생형 K-grass와 그 관상용 품종인 Japanese blood grass의 회귀형을 정확하게 구별할 수 있는 최초의 간소화된 분자적 방법을 제공합니다. 본 프로토콜의 사용자들께서 해당 프로토콜을 통해 얻은 결과를 저희에게 알려주시기를 권장합니다. 이렇게 공유된 정보는 Japanese blood grass의 분포에 관한 정보를 제공하는 데 도움이 될 것입니다.

이는 또한 USDA의 규제 당국이 침입성이 매우 강한 Cogan grass 품종의 확산 및 잠재적 잡종 형성을 방지하기 위해 필요한 조치에 대해 정보에 기반한 결정을 내리는 데 도움이 될 것입니다.