안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사

이 절차의 전반적인 목표는 내향 정류성 칼륨 채널의 활성을 조절하는 새로운 화합물을 발견하는 것입니다. 이를 위해 먼저 관심 있는 KIR 채널을 발현하는 테트라사이클린 유도성 HK 2 9 3 세포를 384 웰 플레이트에 분주합니다. 두 번째 단계는 flu in two라고 불리는 형광 탈륨 리포터 염료를 세포에 로딩하는 것입니다.

다음으로, 결합되지 않은 염료를 세포에서 세척하고, vehicle 대조군 또는 테스트 화합물이 포함된 분석 버퍼로 교체합니다. 마지막 단계는 thallium flux를 유도하기 위해 웰에 자극 버퍼를 첨가하는 것입니다. 최종적으로, 형광 플레이트 리더를 사용하여 KIR 채널을 통한 thallium 이온의 이동을 변화시키는 화합물을 식별합니다.Poor.

수동 패치 클램프 전기생리학과 같은 기존 기술과 비교하여 이 방법의 주요 장점은 연구자가 수백 개의 실험을 동시에 수행하고 매일 수천 개의 실험을 진행할 수 있다는 점입니다. 이 방법을 통해 연구자는 수천 개의 소분자 라이브러리를 스크리닝하여 내향 정류 칼륨 채널의 조절제를 발견할 수 있습니다. 탈륨 플럭스 실험 하루 전, 동반된 원고에 설명된 대로 세포를 분리하고 세포 현탁액의 밀도를 정량화하십시오. 다음으로, 10% 투석 FBS가 포함된 BH 배지를 사용하여, Thermo Multi Drop Combi 또는 멀티 채널 피펫을 이용해 관심 있는 KIR 채널 유전자가 안정적으로 형질전환된 단클론 세포 20,000개를 BD Pure Coat Amin 코팅 384웰 플레이트의 각 웰에 분주하십시오. 다음 날, 현미경으로 플레이트를 관찰하여 세포가 웰 바닥에 부착되어 고르게 분포되어 있는지 확인하십시오.

그런 다음 ELX 4 0 5 마이크로플레이트 세척기를 사용하여 세포 배양 배지를 웰당 20 µL의 HBSS 분석 버퍼로 교체합니다. 그 후, 50 µg의 flus in two 분말을 100 µL의 무수 DMSO에 녹이기 위해 튜브를 짧게 원심 분리하여 2:00 AM D 로딩 솔루션 내의 flus를 준비합니다.

이제 20% weight per volume onic F1 27 DMSO 용액 50 µL를 염료에 추가합니다. 파이펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 2:00 AM onic F1 27 flus 150 µL를 35 mL의 HBSS assay buffer에 추가하고 부드럽게 혼합합니다.

다음으로, 20 µL의 HBSS assay.Buffer가 이미 들어 있는 각 웰에 20 µL의 염료 로딩 버퍼(dye loading buffer)를 추가합니다. 세포가 염료를 흡수할 수 있도록 상온에서 약 1시간 동안 배양합니다. 0.5 g의 탄산수소나트륨을 50 mL의 5x thallium stimulus buffer에 새로 녹여 thallium 자극 플레이트를 준비합니다.

그 다음, 폴리프로필렌 384 웰 플레이트의 각 웰에 용액 50 µL를 첨가합니다. 세포에 형광 물질이 로딩된 후, ELX 405 마이크로플레이트 워셔를 사용하여 플레이트를 세척합니다. 이어서, 각 웰에 HBSS assay Buffer 20 µL 또는 40 µL를 다시 첨가하면 실험 준비가 완료됩니다.

탈륨 플레이트와 세포 플레이트를 액체 분주 기능이 통합된 Hema Matsu 기능적 약물 스크리닝 시스템 또는 이에 상응하는 키네틱 이미징 플레이트 리더에 로드하고, flu oh four와 같은 플루오레신 기반 염료에 적합한 필터를 사용하십시오. 그 후, 40 µL의 HBSS 분석 버퍼가 포함된 세포 플레이트의 해당 웰에 5X 탈륨 시리즈 10 µL를 첨가하는 싱글 애드(single add) 프로토콜을 설정하십시오. 그런 다음 1 Hz 샘플링 빈도로 최소 10초 동안 기저 형광을 기록하십시오.

최적의 세포 플레이팅, 세척 및 로딩 조건이 설정되면 플레이트 전체에서 웰 간의 형광이 균일하고 안정적으로 나타나야 합니다. 그동안 통합된 384채널 피펫터를 사용하여 각 웰에 탈륨 자극 버퍼를 동시에 첨가하고, 오프라인 분석을 위해 탈륨으로 유도된 형광 증가의 속도와 피크가 캡처될 수 있도록 최소 2분 동안 기록을 계속하십시오. 다음 일련의 실험에서는 384웰 플레이트의 각 열과 행의 매 두 번째 웰마다 대조군 억제제를 플레이팅하고, 나머지 웰에는 용매 대조군으로 DMSO를 첨가하여 분석의 균일성과 재현성을 평가하십시오.

멀티채널 피펫을 사용하십시오. 이전에 결정된 농도의 타겟 KIR 채널 억제제 80 µL와 0.1% DMSO 용매를 384-웰 폴리프로필렌 플레이트에 분주하여 화합물 DMSO 플레이트를 제작합니다. 이는 A1 웰부터 시작하여 B2 웰까지 교대로, B24 웰까지 알려진 억제제를 추가함으로써 수행합니다.

B1 웰부터 A24 웰까지 DMSO를 사용하여 이 절차를 반복합니다. 이제 세포 플레이트, 화합물 플레이트 및 thallium 자극 플레이트를 플레이트 리더에 로드합니다. 그런 다음 20 µL의 HBSS 분석 버퍼가 들어 있는 세포 플레이트의 해당 웰에 2X 농도의 화합물 시리즈 20 µL를 추가하는 투여 프로토콜을 설정합니다.

화합물을 세포 플레이트에 첨가하고 실온에서 최대 20분 동안 배양합니다. 두 가지 형광의 기저 형광 값을 최소 10초 동안 기록합니다. 그 다음, 세포 플레이트의 각 웰에 5배 농도의 탈륨 버퍼 10 µL를 첨가합니다.

결과의 재현성을 확립하기 위해 3일 연속으로 실험을 반복합니다. DMSO 내의 thallium flux와 약물 처리된 세포를 사용하여 Z prime 값을 계산합니다. 두 웰 집단 간의 웰 간 변동성에 대한 통계적 척도인 Z prime은 P와 N의 평균 및 표준편차를 기반으로 하며, 여기서 P는 억제되지 않은 flux 값이고 N은 완전히 억제된 flux 값입니다.

3일의 서로 다른 날짜에 측정된 ZPrime 값이 0.5 이상인 분석법은 고속 대량 스크리닝에 적합한 것으로 간주됩니다. 이 그림들은 다양한 유형의 실험에서 사용되는 세포 플레이팅 맵의 몇 가지 예시입니다. 유도되지 않았거나 tetracycline으로 유도된 세포가 포함된 웰의 위치는 서로 다른 색상으로 표시되어 있습니다.

이 그림은 분석법 개발 및 화합물 스크리닝을 위한 최적의 탈륨 농도를 결정하는 데 사용된 소스 플레이트 맵을 보여줍니다. 색상 그라데이션은 100%에서 0.002% 탈륨까지의 3배 희석 시리즈를 나타내며, 여기에는 낮은 탈륨 flux 값에서 높은 값까지를 나타내는 cool-to-hot 색상의 대표적인 형광 강도 맵이 제시되어 있습니다. 탈륨 CRC에 4-파라미터 로지스틱 함수를 피팅하여 보여주는 세포 플레이팅 맵은 15% 탈륨의 EEC 80 값을 결정하는 데 사용됩니다.

이 그림은 분석법의 DMSO 내성을 결정하는 데 사용된 소스 플레이트 맵을 보여줍니다. 1번과 24번 열에는 분석 버퍼만 포함되어 있으며, 색상 그라데이션은 10%에서 0.01% DMSO까지의 2배 희석 시리즈를 나타냅니다. 여기에는 대표적인 형광 강도 맵이 제시되어 있으며, 낮은 thallium flux 값은 더 진한 파란색으로 표시됩니다. 표시된 DMSO 농도가 포함된 웰에서 기록된 평균 thallium flux 값이 여기에 요약되어 있습니다.

이제 이 그림은 KIR 채널의 기지 억제제에 대한 농도 반응 곡선을 설정하는 데 사용된 소스 플레이트 맵을 보여줍니다. 각 화합물은 서로 다른 색상으로 표시되며, 일반적으로 3배 희석 시리즈로 플레이트에 분주됩니다. 여기에 대표적인 형광 강도 맵이 제시되어 있으며, 이 그림은 개발 및 최적화 이후 억제제에 의한 탈륨 플럭스의 용량 의존적 억제를 보여줍니다.

탈륨 플럭스 분석법은 다양한 일상적인 약리학 분석을 수행하는 데에도 사용될 수 있습니다. 탈륨 플럭스 분석법은 이전에 전압 및 리간드 작동성 칼륨 채널, 비선택적 양이온 채널, 그리고 칼륨 수송체에 적용하여 사용한 바 있습니다. 탈륨을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑 착용 및 적절한 폐기물 처리와 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.