태아의 프로그래밍 셀 죽음을 감지 할 LysoTracker의 이용 및 배아 줄기 세포를 차별화

다음 절차의 목적은 세포 사멸 패턴을 감지하기 위해 LysoTracker 염료를 사용하여 두 가지 유형의 시료인 생쥐 배아와 분화된 줄기세포의 리소좀을 유지하는 방법을 시연하는 것입니다. 배아 시료를 준비하려면, 먼저 배아를 외과적으로 분리하여 배양 접시에 넣고 분화된 세포를 준비합니다. 배아 체형을 만들기 위해 배아줄기세포가 사용됩니다.

이 배아체들은 부유 배양된 후 챔버 슬라이드 위에서 단층으로 성장시킵니다. 단층으로 배양된 모든 배아를 LysoTracker Red로 인큐베이션한 후 세척하고 고정합니다. 이후 샘플을 촬영하여 LysoTracker 염색 결과를 확인하고 정량화합니다. 염색은 배아 및 배양 세포에서 프로그램된 세포 사멸을 분석하는 데 사용할 수 있는 간단한 절차입니다.

터널 분석(tunnel analysis)과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 OT 추적 염료가 저분자 물질이기 때문에 두꺼운 조직을 빠르고 쉽게 분석할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 마우스 배아 및 분화 배양액의 프로그램된 세포 사멸 패턴에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 닭 배아 및 분화 중인 성체 줄기세포와 같은 다른 조직 유형에도 적용할 수 있습니다. 젊은 암컷 마우스를 수컷 마우스와 짝지어 주고, 다음 날 아침마다 질전(vaginal plug)이 있는지 확인하여 교배 여부를 판단합니다.

질전(vaginal plug)이 관찰된 날의 정오를 실질적인 0.5일로 간주합니다. 관심 있는 배아일(embryonic day)의 교배 후, 승인된 프로토콜에 따라 암컷을 안락사시키고 자궁을 Hank's BSS가 담긴 10cm 페트리 접시로 옮겨 혈액을 씻어냅니다. 배아들을 분리하여 자궁에서 꺼냅니다.

여분의 배아 막을 제거하고 Hank's BSS로 최소 한 번 헹구어 불필요한 조직과 혈액을 제거합니다. 세척하는 동안 해부한 배아를 얼음 위에 보관하십시오. 나머지 부분도 동일하게 처리합니다.

5 mL의 Liso tracker 배아 염색 용액을 준비합니다. 이 양은 한두 번의 배아 수집에 충분한 부피입니다. 용액을 부드럽게 섞어 염료를 균일하게 분산시킨 후, 배아를 용액으로 옮겨 37 °C에서 45분 동안 배양합니다.

배양 후, 배아를 Hank's BSS로 5분씩 4회 조심스럽게 헹굽니다. 조직이 손상되지 않도록 부드럽게 헹구는 것이 중요합니다. 섬세한 배아의 위치를 세심하게 살피며 액체를 천천히 제거하되, 배아를 덮을 수 있도록 항상 소량의 액체를 남겨두십시오.

그 후 다음 날 4% para formaldehyde에서 배아를 하룻밤 동안 고정합니다. 고정액을 제거하기 위해 Hank's BSS로 배아를 10분 동안 한 번 헹굽니다. 이제 배경 염색을 제거하기 위해 메탄올 시리즈를 통해 조직을 탈수시킵니다.

이 단계는 보관 전 영상 촬영 시 신호 대 잡음비를 향상시킵니다. 필요한 경우, 유전자 분석을 위해 각 배아에서 조직 샘플을 채취하십시오. 이후, 유전자형 분석 전에 조직 샘플을 재수화하십시오.

배아를 조직 샘플과 일치하는 라벨이 부착된 개별 튜브에 나누어 담습니다. 이제 분리된 배아를 -20 °C의 메탄올에 넣어 무기한 보관할 수 있습니다. 차광 보관하십시오.

먼저 행잉 드롭(hanging drop)법을 통해 배아체(embryo bodies)를 준비합니다. 20 µL 드롭당 500 cells의 초기 밀도로 3일간 배양한 후, 배아체를 10 cm 비부착성 페트리 접시의 현탁 배양액으로 옮깁니다. 이를 5일 동안 배양하며, 5일 이후부터는 2일마다 배지를 교체합니다.

배아 몸체를 젤라틴 처리된 8챔버 슬라이드로 옮기고, 각 챔버에 배아 몸체를 하나 또는 두 개씩 배치합니다. 배아 몸체를 10일 동안 더 배양합니다. 10일 후 이틀마다 배지를 교체하며, 기존 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거한 후 각 챔버에 300 µL의 Lyo tracker 세포 염색 용액을 첨가합니다.

피펫 팁을 챔버의 구석에 위치시켜 배지를 수동으로 조심스럽게 파이펫팅하여 제거하십시오. 이렇게 하면 유리 표면에 여전히 부착되어 있는 개체들을 실수로 제거하지 않을 수 있습니다. 배지를 다시 추가할 때도 피펫 팁을 챔버 구석에 두고 배지를 매우 천천히 추가하십시오.

챔버를 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 그 다음 DPBS로 5분씩 두 번 헹굽니다. 이제 실온에서 4% paraldehyde로 15분 동안 세포를 고정합니다.

그 다음 DPBS를 사용하여 5분씩 두 번 헹궈 고정액을 제거합니다. 배아를 마운팅하려면, 배아를 깊은 홈이 있는 유리 슬라이드나 작은 페트리 접시 인펙터 쉴드(infector shield)에 넣습니다. DPBS를 흡입하여 제거함으로써 세포 샘플을 현미경 관찰이 가능하도록 준비합니다.

슬라이드에서 챔버를 제거하고 약 5분 동안 자연 건조시킵니다. 형광 물질을 보호하기 위해 알루미늄 호일로 덮어줍니다. 그런 다음 DAPI가 포함된 Vector Shield와 같은 수성 마운팅 매질을 첨가하고 그 위에 커버슬립을 덮습니다.

이제 슬라이드 마운팅이 완료되어 이미지 촬영 준비가 되었습니다. Rodamine 또는 Texas red 필터가 장착된 실체 현미경이나 복합 현미경으로 시료를 관찰하십시오. 염색 상태가 보통 매우 밝으므로, 수동 모드에서는 긴 노출 시간이 일반적으로 필요하지 않습니다.

모든 샘플을 동일한 노출 조건에서 디지털 사진으로 촬영합니다. 이미지를 정량화하려면 Adobe Photoshop 또는 이와 유사한 이미지 분석 프로그램을 사용하여 사진을 엽니다. lyo tracker 염색 정도를 결정하려면 레드 채널을 선택합니다.

히스토그램 기능을 통해 확인된 전체 이미지의 픽셀 수를 기록하십시오. 다음으로, 적색 염색 부위가 흰색 픽셀로 표시되도록 이미지를 임계 처리(threshold)합니다. 이 과정을 통해 이미지가 흑백으로 변환됩니다.

임계값 수준을 설정하고 세트 내의 모든 이미지에 이 수준을 적용하십시오. 색상 범위 도구를 사용하여 흰색 픽셀을 선택하고, 히스토그램 기능을 사용하여 전체 흰색 픽셀 수를 구하십시오. 청색 채널을 사용하여 시야 내의 핵 수를 계산하십시오.

이미지에 주석을 달아 세포 수를 기록하고, 해당 값을 기록한 뒤 이를 사용하여 세포당 평균 염색 수준을 계산하는 것이 유용할 수 있습니다. 나머지 모든 이미지에 대해 동일한 임계값 설정을 적용하여 이 분석을 반복하십시오. 샘플링을 위해 LysoTracker를 사용하여 sonic hedgehog 돌연변이 배아를 염색하였습니다.

ly O tracker는 크기가 작고 확산성이 높은 분자이므로, 교배 후 10.5일에 염색된 전체 배아의 심부 영역을 관찰하였습니다. 그 결과, sonic hedgehog 결핍 돌연변이 배아에서 프로그램된 세포 사멸(PCD)이 크게 증가하였으며, 특히 사지 및 체절 영역에서 두드러지게 나타났습니다. 전체적인 패턴을 평가하기 위해 사지 싹(limb buds)을 고배율로 홀 마운트(whole mount) 이미징 하였으며, 적출된 일부 부위는 진동 마이크로톰(vibrating microtome)을 이용하여 절편을 제작하였습니다.

화살표는 크라이오스탯(cryostat)으로 얻은 절편에서 sonic hedgehog null 원위단(distal tip)의 TUNEL 염색 증가를 가리킵니다. 이 절편들에서는 OT Tracker와 TUNEL 염색을 병행하여 사용하였으며, LysoTracker와 TUNEL 염색 사이에 엄격한 일대일 상관관계가 있는 것은 아니나, 고배율에서 PCD가 발생하는 일반적인 영역이 상당 부분 겹칩니다. TUNEL 분석에서 양성으로 염색된 세포, LysoTracker로만 염색된 세포, 그리고 두 염색이 중첩되어 나타나는 세포를 모두 확인할 수 있습니다. 10일간의 배아 체내 배양 후, 세포들은 뉴런, 근육 세포, 심근세포를 포함한 다양한 세포 유형으로 분화되었습니다.

분화된 ES 세포의 일반 배양에서는 lyo tracker 및 tunnel 분석으로 검출되는 소수의 PCD 발생 세포들이 관찰됩니다. 다음으로, 산화적 스트레스에 의한 세포 사멸을 유도하기 위해 세포에 과산화수소를 처리하였습니다. 과산화수소를 저농도로 처리했을 때, 처리하지 않은 경우와 비교하여 lyo tracker 및 tunnel 염색이 모두 증가하였습니다.

배아에서의 결과와 유사하게, 두 가지 염색 모두 공통 세포와 고유 세포를 표지하였습니다. 고농도의 과산화수소 처리는 세포 수축을 유발했으며, OT 트래커와 tunnel 양성 반응이 더 광범위하게 나타났습니다. 비교를 위해, 1시간의 혈청 기아 상태를 통해 자가포식을 유도하였습니다.

OT tracker 염색이 증가하였습니다. 하지만 tunnel 양성 반응은 정상 수준을 유지하였습니다. 따라서 reer은 간편하고 유용하지만, 샘플 정량 후 해당 염색이 세포사멸(apoptosis)을 나타내는지 아니면 자가포식(autophagy)을 나타내는지 결정하기 위해 추가 분석으로 후속 확인을 하는 것이 중요합니다.

앞서 시연한 간단한 Photoshop 방법을 사용하여 분석한 결과, 과산화수소의 농도가 증가할수록 Lysotracker 염색 수준이 더 높아지는 것이 확인되었습니다. 이 염색 절차를 숙달하고 적절히 수행한다면 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차 이후, 세포 사멸의 유형을 확인하기 위해 Annexin V 또는 LC3 면역 염색과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 현재 Tracker Green은 살아있는 세포에서만 작동하므로, 고정이 필요한 시료에는 Track Red가 가장 적합한 선택지라는 점에 유의하십시오.