SeqA-DNA 단지의 결정에 대한 DNA의 Duplexes의 최적화를 반복

본 실험에서는 탠덤 반메틸화 GATC를 포함하는 DNA에 결합된 단백질의 회절 품질 결정(diffraction quality crystals)을 얻는 방법을 상세히 설명합니다. 단백질-DNA 복합체의 결정 패킹을 최적화하기 위해 이를 반복합니다. 우선 DNA 길이, GATC 간격 및 DNA 말단의 합리적 설계부터 시작하여, 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 DNA를 정제한 후 어닐링(anneal)하여 반메틸화 DNA 이중 가닥을 형성하고, 정제된 seq A를 혼합하여 복합체를 형성하는 과정으로 진행합니다.

다음으로, 상용 희소 행렬 스크린(sparse matrix screens)을 이용한 결정화 시험을 통해 단백질-DNA 복합체의 회절 품질 결정 성장을 위한 최적 조건을 찾습니다. 입증된 결과들을 공유합니다. DNA 길이, GATC 간격 및 말단 변화가 CQ A DNA 결정의 회절 품질에 미치는 영향을 설명합니다.

본 연구의 목적은 DNA와 결합된 CK의 회절 품질 결정체를 얻는 것이며, 아울러 다른 단백질-DNA 복합체의 결정을 위한 DNA 이중 가닥을 설계할 때 고려해야 할 일반적인 변수들을 이해하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 본 절차는 본 연구실의 박사후 연구원인 Chang, A가 사용할 예정입니다. 본 연구에서는 DNA 복합체 형성 및 DNA 결합 도메인 사이의 링커 영역이 단축되어 안정적인 이량체를 형성하는 DNA 복제 조절 단백질의 변이체를 사용합니다.

이 변형체는 DNA 결합 범위를 DNA 상의 한 회전으로만 분리된 탠덤 GATC 반복 서열로 제한합니다. 먼저 T7 프로모터의 제어를 받는 DEMETRIC seq A를 인코딩하는 플라스미드로 BBL 20 1D 3 세포를 형질전환합니다. 형질전환 반응액을 100 µg/mL의 ampicillin이 함유된 LB agar 플레이트에 도말하고 박테리아 배양기에 넣어 하룻밤 동안 배양합니다. 혼합 콜로니를 선택하여 소규모의 하룻밤 배양을 시작합니다.

다음 날 아침, 10 mL의 밤샘 배양액을 사용하여 1 L 배양액에 접종합니다. 배양액이 대수 성장기에 도달하면, 단백질 생산을 유도하기 위해 0.5 M IPTG 2 mL를 첨가합니다. 37 °C 궤도 진탕 배양기에서 3시간 동안 배양을 지속합니다.

그 다음 3,300 G에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 세포 펠렛을 정제 버퍼 A에 현탁한 후 초음파 처리를 통해 세포를 파쇄하고, 39,000 ×G에서 40분 동안 원심분리하여 용해물을 투명하게 만듭니다. 이제 상층액을 정제 버퍼로 평형화된 헤파린 컬럼에 로딩합니다.

CK 단백질을 용출시키기 위해, 1 M sodium chloride까지의 선형 구배(linear gradient)를 사용합니다. CK 단백질은 약 0.7 M sodium chloride에서 용출됩니다. CK가 포함된 분획을 수집하고 희석하여 시료의 이온 강도를 낮춥니다.

그다음, 정제 버퍼로 평형화된 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 시료를 로딩합니다. 선형 염 농도 구배를 적용하여 약 0.4 molar sodium chloride에서 순수한 CK 단백질을 용출합니다. CK가 함유된 분획들을 수집하여 결합합니다.

3 mg/mL 농도로 농축하여 보관하십시오. 완충액 설계를 위해 상보적인 비메틸화 및 메틸화 올리고뉴클레오타이드를 준비합니다. 동결 건조된 각 단일 가닥 DNA 1 µmol을 800 µL의 오토클레이브 멸균 2중 증류수에 넣어 샘플을 조제한 후, 볼텍싱하고 15분간 방치하십시오. 이제 800 µL를 사용합니다.

20~30 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드를 위해 각 샘플에 예열된 2배 농도 로딩 버퍼를 첨가하고, 10% 변성 젤을 크게 준비합니다. 중합이 완료되면 콤을 제거하고 웰을 충분히 헹굽니다. 상단 및 하단 리저버를 1배 농도 TBE 전개 버퍼로 채워 젤 장치를 조립합니다.

젤을 750V로 예비 주행시켜 55°C까지 가열합니다. 그 후 주행을 중단하고 웰을 주행 버퍼로 충분히 헹굽니다. 이제 올리고뉴클레오타이드를 90°C에서 2분 동안 가열합니다.

볼텍싱하고 원심 분리합니다. 샘플을 즉시 겔에 로딩합니다. 올리고뉴클레오타이드가 이동할 때까지 약 700V에서 겔 전기영동을 수행합니다.

10% poly acrylamide 겔의 중간 지점에서 alph phenol blue는 약 20개 염기 길이의 올리고뉴클레오타이드와 함께 이동하며, xylene syl ff는 약 60개 염기 길이의 올리고뉴클레오타이드와 함께 이동합니다. 장치에서 겔을 분리하고 평평한 표면에서 스페이서를 제거하십시오. 유리판 하나를 제거하고 겔을 플라스틱 랩으로 덮으십시오.

그런 다음 젤을 뒤집어 다른 유리판을 제거하고 젤을 플라스틱 랩으로 덮습니다. 다음으로 젤 뒤에 UV 라이트와 형광판을 배치하여 밴드 위치를 표시합니다. 면도날로 DNA 그림자를 확인하며 밴드를 절제하고 작은 조각으로 자릅니다.

각 샘플을 멸균된 15 milliliter 튜브로 옮깁니다. 9 milliliter의 용출 버퍼를 넣고 37 degrees Celsius에서 교반하며 하룻밤 동안 희석합니다. 겔 로딩 파이펫 팁을 사용하여 용액을 오토클레이브 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

아크릴아마이드 조각의 전이를 방지하기 위해, pH 7의 3mM 소듐 아세테이트 1mL와 냉각된 100% 에탄올 25mL를 첨가하고 -20°C에서 최소 3시간 동안 배양하십시오. 침전된 DNA를 원심분리하십시오. 그 후 speed vac의 중간 온도에서 펠릿을 건조시키고, 각 펠릿을 오토클레이브 멸균된 2중 증류수 400µL에 재현탁하여 새 튜브로 옮기십시오.

pH 7의 3 M 아세트산 나트륨 40 µL와 100% 에탄올 1 mL를 첨가하고 볼텍싱한 후 -20 °C에서 30분 동안 배양합니다. 18,000 ×g에서 15분 동안 원심분리한 후, 잔류 염을 제거하기 위해 70% 차가운 에탄올 100 µL로 DNA 펠릿을 세척합니다. 18,000 ×g에서 6분 동안 원심분리한 다음, 에탄올을 제거하고 스피드백(speed vac)으로 펠릿을 건조시킵니다.

이제 각 펠렛을 100 µL의 오토클레이브 멸균 2차 증류수에 다시 현탁합니다. 분광 광도법을 사용하여 올리고뉴클레오타이드의 농도를 결정합니다. 반메틸화 DNA 이중나선을 준비하려면 먼저 상보적인 단일 가닥들을 동일한 몰 농도로 혼합합니다.

그 다음, 가닥을 어닐링하기 위해 혼합물을 항온수조에서 95 °C로 5분 동안 가열합니다. 수조 내에서 시료가 실온까지 천천히 식도록 둡니다. 81 µM으로 정제된 CQ a 단백질과 81 µM의 hemi-methylated DNA를 동일한 부피로 혼합합니다.

그 다음 실온에서 15분 동안 배양합니다. 상용 희소 행렬 스크리닝 키트를 사용하여 결정화 조건을 확인하기 전까지 4°C에서 보관하십시오. 초기 결정화 리드가 확인되면, 회절 품질의 결정을 성장시키기 위해 조건을 최적화하십시오. 결과물인 CK DNA 결정을 동결 보호 처리하십시오.

결정화 용액 내 PEG 400의 양을 최종 농도 25%가 되도록 높이거나, 결정화 용액에 20% glycerol을 첨가하십시오. 나일론 루프로 개별 결정을 떠냅니다. 액체 질소에서 샘플을 급속 냉동하십시오.

이제 100 K에서 각 결정의 회절 한계를 테스트합니다. Hemi methylated DNA에 결합된 CK 단축 돌연변이체의 결정 구조를 얻기 위해, Hemi methylated GATC 서열 간의 간격, 이중 가닥의 길이, 그리고 5' 오버행의 유무라는 DNA의 세 가지 매개변수를 순차적으로 최적화합니다. 본 연구에서는 말단 도메인에 추가적인 리간드 결합을 방지하는 점 돌연변이와 DNA 결합을 탠덤으로 제한하는 단축된 링커를 가진 seek a의 DME 변이체를 사용합니다.

DNA 전기영동 이동성 변화 분석(electromobility shift assays) 결과, GATC 반복 서열이 정확히 한 회전(one turn)만큼 떨어져 있을 때 나타나는 양상은 변형된 CK 단백질이 9~10 염기쌍 거리로 떨어진 GATC 반복 서열에 우선적으로 결합함을 나타냅니다. 따라서 초기 스크리닝에는 9 또는 10 염기쌍 거리로 떨어진 두 개의 반메틸화(hem methylated) GATC 반복 서열을 포함하는 23~24 염기쌍 길이의 이중 가닥 DNA를 사용합니다.

세 개의 이중 가닥체에서 모양이 고른 결정들이 얻어졌습니다. 어떤 결정도 고해상도로 회절되지는 않았으나, 데이터 분석 결과 9개의 염기쌍으로 이루어진 A-G-A-T-C 분리가 결정화에 유리한 것으로 나타났습니다. 예상 밖으로 두 GATC 사이로 CG 이뉴클레오티드를 포함시켜 홈-백본 상호작용을 강화했음에도 불구하고 결정의 회절 한계는 변하지 않았습니다.

반면, 오버행의 길이를 최적화함으로써 분자 접촉과 결정 형태가 크게 변화했습니다. 이 CK 단백질과 반메틸화 DNA 이중나선의 복합체 결정 구조를 통해, 단백질과 DNA의 상대적 크기에도 불구하고 DNA 이중나선의 자유면은 결정 접촉에 참여하지 않음을 확인했으며, 대칭 짝 사이의 대부분의 상호작용은 단백질-단백질 및 단백질-DNA 상호작용에 의해 매개됩니다. 흥미롭게도, 이 특정 사례에서 5' 말단 디뉴클레오티드 오버행의 유익한 효과는 유사 연속 DNA의 형성에 의한 것이 아니었습니다.

대신에, 메틸화된 가닥의 5' 말단은 DNA 축에서 바깥쪽으로 돌출되어 복합체의 인접한 CK 분자와 상호작용하며, 이는 왜 결정 패킹을 변화시키기 위해 두 개의 뉴클레오타이드가 엄격하게 필요했는지를 설명해 줍니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 단백질을 정제하고 단백질-DNA 복합체 결정을 위한 DNA 이중 가닥을 설계하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 본 프로토콜은 CK-DNA 복합체를 결정화하기 위해 고안되었지만, DNA 길이, 서열 및 말단의 합리적인 최적화는 다른 단백질-DNA 복합체의 결정을 위한 DNA 이중 가닥 설계에 일반적인 틀을 제공한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.