3DNA과 핵산의 구조를 분석하고 구축

이 절차의 전반적인 목표는 실험실 과학자 및 기타 연구자들이 최첨단 계산 도구를 사용하여 DNA 및 RNA의 공간적 조직을 조사할 수 있도록 3D NA 프로그램 제품군을 제공하는 것입니다. 이를 위해 먼저 3D NA 포럼에서 소프트웨어를 다운로드하여 로컬 컴퓨터에 설치합니다. 두 번째 단계는 구성 염기쌍 단계 수준에서 대표적인 DNA 구조를 분석하는 것입니다.

다음으로, 동일한 DNA 구조를 염기쌍 단계 수준에서 수정하고, 새로 정의된 염기쌍 단계 파라미터를 사용하여 재구축합니다. 이어지는 단계는 관련된 구조들의 거대한 앙상블을 분석하는 것입니다. 마지막 단계는 구조의 전반적인 왜곡을 시각화하기 위해 일련의 관련 DNA 구조들을 공통 참조 프레임에 정렬하는 것입니다.

궁극적으로 3D NA 도구는 약물 및 단백질과 결합된 염기쌍 단계를 포함하여 개별 염기쌍 단계가 DNA의 전체적인 폴딩에 어떻게 기여하는지 조사하고, 상당한 수준의 전역적 왜곡이 발생하는 부위와 방향을 식별하는 데 사용됩니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 소프트웨어가 견고하며 다양한 핵산 함유 구조에 광범위하게 적용 가능하다는 점입니다. 이 방법은 게놈이 3차원적으로 어떻게 구성되는지, 그리고 DNA가 어떤 종류의 변형을 일으킬 수 있는지와 같은 생화학 및 생물물리학의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

소프트웨어 패키지 설치를 시작하려면, three DA 웹사이트(xthreed. org)에 접속하여 3D NA 포럼 링크를 클릭하십시오. 포럼 내에서 가입 링크를 선택하고 안내 지침에 따라 새 계정을 생성하십시오.

사용자 이름과 비밀번호가 설정되면 포럼에 로그인하여 환영 섹션의 다운로드 링크를 선택하고, 새 페이지에서 3D NA download를 선택하십시오. tar gz 파일을 더블 클릭하여 3D NA 소프트웨어가 포함된 X 3D NA dash V 2.1이라는 이름의 폴더를 생성하십시오. Macintosh의 유틸리티 항목에서 일반적으로 찾을 수 있는 터미널 애플리케이션을 열고 X 3D NA dash V 2.1 디렉토리로 이동하십시오.

3D NA가 제대로 작동하는 데 필요한 설정 스크립트를 실행하십시오. 이 비디오에서 사용된 모든 명령어는 텍스트 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. 다음으로, 화면에 출력되는 두 줄의 내보내기 설정을 복사하십시오.

사용자가 소프트웨어를 애플리케이션 디렉토리에 배치했다면, 두 줄이 여기 보이는 것과 같이 나타나야 합니다. 애플리케이션 디렉토리에 있는 텍스트 편집 애플리케이션을 엽니다. 포맷 메뉴에서 일반 텍스트 만들기(Make plain text)를 선택합니다.

bashrc 파일이 존재하는 경우, 텍스트 편집기로 파일을 열어 파일 끝에 export 설정을 편집하여 붙여넣으십시오. bashrc 파일이 없는 경우, 빈 파일에 export 설정을 붙여넣고 홈 디렉토리에 bashrc라는 파일 이름으로 저장하십시오. 새로운 설정을 적용하려면 터미널 프로그램 내에서 새로 저장한 bashrc 파일을 실행하십시오.

이 영상에서는 대표적인 핵산 구조인 Borrelia bergdorfii 박테리아 유래 HBB 단백질에 결합된 DNA의 분석 방법을 보여줍니다. 3D NA 분석의 첫 번째 단계는 모든 염기쌍의 목록이 포함된 파일을 생성하는 것입니다. 이는 NP2MP2.pdb 파일에 저장된 원자 구조에 Find pair 프로그램을 적용하는 명령어를 입력하여 수행합니다.

분석의 다음 단계는 구조를 특징짓는 기하학적 파라미터를 결정하는 것입니다. analyze 명령은 염기쌍 파일을 입력값으로 받아 작업 디렉토리에 여러 출력 파일을 생성합니다. 그 다음, analyze two MP two bps를 입력하여 기하학적 수치를 계산할 수 있습니다.

생성된 출력 파일에는 계산된 매개변수의 개요가 포함된 two MP two out과 강체 매개변수 목록이 포함된 bpco step par가 포함됩니다. 핵산 구조 분석 외에도, 3D NA 소프트웨어는 rebuild 명령어를 사용하여 강체 매개변수로부터 구조 모델을 구축하는 기능을 제공하며, 이를 통해 백본과 염기 원자의 좌표가 모두 포함된 근사 원자 모델을 생성할 수 있습니다. 텍스트에 기재된 명령어를 입력하십시오. 이 명령어는 3D NA가 강체 매개변수로부터 모델을 구축할 때 표준 BDNA 백본 형태를 도입하도록 지시합니다.

적절한 명령어를 입력하면 H-B-B-D-N-A 구조에서 발견된 강체 파라미터를 가진 이중 나선 모델을 구축할 수 있습니다. 수정된 구조를 생성하기 위해 bpco step par 파일을 편집할 수 있습니다. 여기서는 굽힘이 가장 심한 두 지점에서 형성된 극심한 롤 각도를 수정합니다.

그런 다음 수정된 단계 매개변수 세트를 입력 파일로 사용하여 구조를 구축합니다. 단일 핵산을 포함하는 구조의 분석과 달리, 두 모델을 표준 분자 뷰어로 확인할 수 있습니다. 이 비디오 부분에서는 MD_set1.pdb로 시작하여 숫자로 끝나는 일련의 파일들에 포함된 대규모 구조 앙상블을 분석하는 방법을 보여줍니다.

분석의 첫 번째 단계는 이전과 같이 find pair 프로그램을 실행하여 얻은 쌍을 이룬 염기들을 식별하는 것입니다. 전체 구조 세트가 동일한 염기 쌍 형성 체계를 공유하므로, 여기서는 대표 파일인 1001로 끝나는 파일에 대해 find pair를 한 번만 실행하면 됩니다. 이렇게 하면 염기 쌍 형성 정보가 생성되어 MD at set one BPS PS 파일에 저장됩니다. 다음 단계에서는 Command X 3D ncore ensemble.Analyze를 사용하여 전체 구조 세트의 기하학적 파라미터를 찾습니다. 그런 다음 overview 출력 파일인 MD at set one out에서 원하는 강체 파라미터를 추출할 수 있습니다.

이 과정은 Command X three DCO 앙상블 추출물을 사용하여 수행됩니다. 롤 각도를 추출하여 롤 각도가 쉼표로 구분된 텍스트 파일을 생성합니다. 이 파일은 추가 분석 및 플로팅을 위해 다른 프로그램으로 불러올 수 있습니다.

3D NA의 최신 버전에는 사용자가 공통된 관점에서 여러 구조를 살펴볼 수 있는 새로운 기능이 포함되어 있습니다. X three DCO ensemble reorient 명령은 이전 프로토콜과 마찬가지로 관련 구조 모음을 공통된 염기쌍 또는 염기쌍 단계(base pair step)에 중첩시킵니다. 첫 번째 단계는 find pair 프로그램을 사용하여 DNA의 염기쌍 형성을 계산하는 것입니다.

이 사례에서 입력 파일은 두 개의 KEK pdb 파일로, LAC Repressor 단백질의 헤드피스에 결합된 O 3D NA 오퍼레이터의 CIA coli 구조 10개가 포함되어 있습니다. Command X three DCO ensemble reorient는 다중 모델 구조 내의 개별 모델들을 공통 참조 프레임에 정렬합니다. 이 명령에는 PDB 파일과 이전 단계에서 생성된 염기 쌍 형성 파일이 모두 입력값으로 필요합니다.

또한 명령어에는 모든 구조의 정렬 기준이 되는 염기쌍 단계의 식별 정보가 포함됩니다. W 3D NA 웹 인터페이스에는 3D NA 소프트웨어 패키지의 몇 가지 인기 있는 기능들이 포함되어 있습니다. 이 영상 섹션에서는 웹 서버를 통해 단백질이 결합된 DNA의 3차원 모델을 구축하는 기능에 주목합니다.

단백질이 결합된 DNA 모델을 구축하는 첫 번째 단계는 W 3D NA 웹사이트(W three d.rutgers.edu)에 접속하는 것입니다. 페이지 왼쪽 상단 메뉴에서 'reconstruction'을 선택하면 온라인 모델 구축 기능을 활성화할 수 있습니다. 다음 단계는 새 페이지 중앙의 연한 색 상자 안에 있는 'bound protein DNA template' 링크를 선택하는 것입니다.

이 선택 항목을 클릭하면 드롭다운 메뉴가 활성화되며, 사용자는 결합된 단백질의 수를 지정할 수 있습니다. 결합 단백질 수를 선택하면 새로운 지정 페이지로 이동합니다. 그런 다음 사용자는 원하는 서열을 직접 입력하거나 붙여넣을 수 있습니다.

새 페이지 중앙의 텍스트 상자 아래에는 DNA 비결합 영역의 나선 구조를 선택할 수 있는 드롭다운 메뉴가 있습니다. 설정 페이지 하단 근처에는 결합 단백질의 결합 위치와 파일 이름을 입력하는 텍스트 상자가 있습니다. 결합 위치는 DNA 서열상에서 단백질 결합 단편 중심의 위치를 지정합니다.

사양 페이지 하단에는 단백질 결합 DNA의 미리보기를 생성할 수 있는 확인란이 있습니다. 여기서는 해당 확인란을 선택하고 계속 버튼을 클릭합니다. 이 작업을 통해 선택한 파라미터 목록과 선택한 결합 부위의 중첩으로 인해 발생했을 수 있는 오류가 표시되는 검토 페이지가 생성됩니다.

사용자는 변경 사항이 필요한 경우 뒤로 가기 버튼을, 계속 진행하려면 생성 버튼을 선택할 수 있습니다. 다음 페이지에는 DNA 단백질 복합체가 가장 길게 뻗어 있는 상태의 정지 이미지가 표시되며, 웹을 통해 온라인 상호작용 시각화가 가능합니다. 사용자는 원자 좌표가 포함된 파일도 다운로드할 수 있습니다.

3D NA 소프트웨어 도구는 핵산 구조를 분석하는 데 일상적으로 사용됩니다. 강체 파라미터 값은 3차원 구조의 왜곡을 나타내며, 예를 들어 13번과 22번 단계에서 발견되는 큰 양의 롤 각도를 가진, 메이저 그루브 방향으로 극심하게 굽은 두 곳의 DNA 부위가 이에 해당합니다. 이는 Borrelia Bergdorf, RHBB 단백질과 DNA의 결정 복합체에서 확인됩니다.

이러한 수치들을 바탕으로 구조를 재구축하는 소프트웨어의 기능 덕분에, 개별 염기 및 염기쌍 단계가 전체적인 분자 접힘에 어떻게 기여하는지 결정할 수 있습니다. 여기에서 보여주는 바와 같이, HBB에 의해 유도된 DNA의 전반적인 굽힘은 위에서 언급한 두 가지 극단적인 역할 왜곡 이상의 것을 반영합니다. 이러한 염기쌍 단계들을 직선화하여 재구축하더라도 DNA는 여전히 심하게 굽어 있는 상태로 유지됩니다.

이는 롤(roll)의 가장 큰 두 값이 0으로 설정되었을 때를 의미합니다. 3D NA의 새로운 기능을 통해 수많은 관련 구조를 조사함으로써, 시뮬레이션된 DNA 및 RNA 분자의 공간적 배치에서 서열 및 시간에 따른 패턴을 모두 추출할 수 있게 되었습니다. 예를 들어, 두 개의 대규모 시뮬레이션 DNA 구조 집합에서 연속적인 염기쌍 간의 롤 각도에 노란색 코팅을 입히면, 이러한 분자들이 퓨린 염기쌍 단계에서 우선적으로 굴곡됨을 알 수 있습니다.

DNA 말단에서 짧은 기간 동안 지속되며 빨간색으로 표시된 높은 롤(roll) 값은 이중 나선 구조의 국소적인 해동 및 재결합을 시사합니다. 상보적 염기 사이의 각도 및 거리와 같은 다른 강체 파라미터의 변동 패턴은 정밀한 구조적 왜곡을 파악하는 데 도움이 될 수 있습니다. 관련 분자들을 공통 참조 체계에서 재정렬하는 3D NA 소프트웨어의 기능은 단백질 데이터 뱅크(protein data bank)에 저장된 많은 파일 속에 숨겨진 전반적인 구조적 특징을 드러냅니다.

예를 들어, 상응하는 원자들의 평균 제곱근 적합도(root mean square fit)를 기반으로 관련 구조들을 관습적으로 정렬하면 여기에서 서로 대략적으로 겹치는 일련의 유사한 공간적 경로가 생성됩니다. 이는 LAC 억제 단백질의 헤드 부분에 결합된 Escherichia coli O3 DNA 오퍼레이터의 10가지 NMR 기반 모델로, 각 이중 가닥의 5' 말단 염기쌍을 공통 좌표계에 맞춰 동일한 구조들을 중첩시키면 분자들이 상당히 다른 방향으로 굴곡지는 전반적인 구조의 상당한 왜곡이 드러납니다. 이러한 구조적 가변성은 Escherichia coli LAC 억제 단백질이 O3에 결합하여 LAC 오퍼론 내의 O3와 순차적으로 떨어진 오퍼레이터 사이에 루프를 유도하는 용이성에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기서 보여주는 바와 같이, Borrelia burgdorferi 유래 HBB와 같은 구조 단백질의 정밀한 배치는 DNA의 전체적인 폴딩(folding)에 극적인 영향을 줄 수 있습니다.

알려진 고해상도 구조의 두 복제본이 43 base pair만큼 떨어져 있는 경우, 81 base pair의 DNA 단편은 조밀하고 거의 원형인 구성으로 닫힙니다. 만약 두 단백질이 추가로 5 base pair만큼 더 떨어져 있다면, DNA는 개방된 굽이치는 경로를 따르게 됩니다. 단백질이 결합된 이중나선의 매우 상이한 배열은 구조 단백질의 간격이 DNA의 환형화 또는 루핑(looping)에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지를 보여줍니다.

이 기술은 핵산 구조 생물학 분야의 연구자들이 DNA-단백질 상호작용, RNA 폴딩 및 나노입자 설계를 탐구함으로써 발달 결함과 암과 같은 질병에 대한 이해를 높이고 새로운 치료제를 설계할 수 있는 길을 열어주었습니다.