2012년 10월 25일
자유 수영 선충류와 같은 미세한 미생물 C. elegans 생활하고 복잡한 입체 환경에서 동작합니다. 우리는 분석을 제공하는 새로운 접근 방식을보고 C. elegans 회절 패턴을 사용합니다. 이 방법은 큐벳을 통해 레이저 빛을 감독에 의해 생성 된 회절 패턴의 시간 주기성을 추적으로 구성되어 있습니다.
이 실험 절차의 전체적인 목표는 자유롭게 헤엄치는 미세 생물의 thrashing 빈도를 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 미세 충 샘플을 준비합니다. 그다음, 광학 설정을 준비합니다.
그 후 살아있는 유기체에 의해 생성된 회절 패턴을 기록합니다. 마지막으로, 기록된 데이터를 분석하여 유영 빈도를 결정합니다. 최종적으로, 회절 분석을 통해 구속되지 않은 벌레의 이동 패턴 변화를 보여줍니다.
기존의 전통적인 현미경 관찰과 같은 방법들에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은, 해당 종이 3차원 공간에서 자유롭게 이동하는 동안의 유영 패턴을 관찰할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 자유롭게 유영하는 C. elegans에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 다양한 조건에 노출된 다른 투명하고 작은 미세 생물들에게도 적용될 수 있습니다. 비디오 분석을 위해 C. elegans를 준비하려면, 납작한 백금 와이어 픽을 사용하여 10~20마리의 성체 네마토드를 새로운 NGM으로 옮기는 것부터 시작하십시오.
E. coli가 작은 원형 반점 형태로 포함된 한천 충전 페트리 접시입니다. 선충이 3~5시간 동안 알을 낳도록 한 뒤 성충을 제거하십시오. 이렇게 하여 50~150마리의 발달 단계가 동기화된 소규모 배양군을 형성하고, 선충을 초기 성체 단계까지 성장시키기 위해 페트리 접시를 20 °C에서 4~5일 동안 배양하십시오.
비디오 분석 당일에 탈이온 증류수 1 mL를 사용하여 성체 초기 단계의 선충이 있는 플레이트를 세척함으로써, 동기화된 배양액에서 50~150마리의 벌레를 수집합니다. 마이크로 원심분리기를 사용하여 벌레를 튜브 바닥으로 가라앉히거나, 약 15분 동안 중력에 의해 가라앉도록 둡니다. 튜브에서 대부분의 물을 제거하고 탈이온 증류수 1 mL로 교체하여 선충에 부착된 박테리아를 세척합니다.
마이크로 파이펫을 사용하여 물에 있는 선충 5~10마리를 석영 큐벳으로 옮깁니다. 543 nm 헬륨-네온 레이저, 레이저 빔을 큐벳으로 유도하는 데 사용되는 전면 반사 알루미늄 거울 2개, 큐벳 홀더, 투영 스크린, 그리고 초당 약 240프레임으로 촬영 가능한 고속 카메라를 사용하여 여기와 같이 광학 장치를 구성합니다. 다음으로, 파라필름 조각으로 큐벳 윗부분을 덮고 이를 뒤집어 선충들이 수중에 섞이도록 합니다.
웜들이 초기에 vete 상단에 위치하도록 vete를 vete 홀더에 배치합니다. 거울을 사용하여 레이저 빔이 vete의 중심을 통과하도록 조정합니다. 선충은 물보다 밀도가 높기 때문에, 투사 스크린 상의 수중 칼럼 내에서 유영하며 vete 바닥으로 천천히 가라앉게 됩니다. 투과된 레이저 빔이 투사 스크린에 닿을 때 산란을 줄이기 위해, 투과된 레이저 빔에 해당하는 지점을 검은색으로 칠합니다.
투과 빔의 산란을 제거하거나 줄이면 투과 빔으로 인해 카메라의 CCD 어레이가 포화되는 것을 방지할 수 있습니다. 회절 패턴의 크기를 측정하기 위해, 회절광 이미지에 영향을 주지 않도록 투과 레이저 빔 스폿 옆의 투영 스크린에 약 5cm 길이의 선을 긋습니다. 실내 조명을 끄고 벌레들이 레이저 빔을 통과할 때 스크린에 나타나는 회절 이미지를 기록합니다.
비디오 데이터를 준비하려면, 다음의 비디오 분석 프로그램을 설치하고 프로그램을 통해 비디오를 불러옵니다. 소프트웨어를 사용하여 투과된 레이저 스폿과 원점이 일치하도록 설정하십시오. 각 선충에 의해 형성된 회절 이미지의 각변위를 추적하십시오.
데이터를 스프레드시트에 복사하여 붙여넣고, 연속적인 그래프를 생성하기 위해 모든 음수 각도에 180도 또는 PI를 더합니다. 비디오 분석 설정을 사용하여, USB 포트를 통해 투영 스크린 바로 앞에 회절 패턴의 중심에서 벗어난 지점에 작은 면적의 포토다이오드를 배치합니다.
포토다이오드를 컴퓨터에 연결된 디지털 오실로스코프에 연결합니다. 컴퓨터 화면에서 요동치는 패턴을 관찰하십시오. 데이터 분석을 위해 데이터 세트를 ASCII 또는 텍스트 형식으로 저장합니다.
비디오 또는 사진을 사용하여 파형 피팅이 가능한 데이터 분석 프로그램으로 데이터를 가져옵니다. 카이제곱(chi-square) 최소화법을 사용하여 사인 곡선을 피팅함으로써 요동 빈도를 결정합니다. 다양한 샘플의 유영 빈도를 평균하고 분산을 결정합니다.
본 연구의 데이터는 일원 분산 분석(single factor ANOVA) 후 Bonferroni 다중 비교 테스트를 사용하여 통계적으로 분석되었습니다. P 값이 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의미한 것으로 간주하여 회절 패턴을 모델링하였습니다. 먼저 현미경을 사용하여 이미지를 촬영하고 이미지를 최적화하는 것으로 시작하십시오.
이를 Mathematica로 드래그하십시오. binary eyes 명령어를 사용하여 흑백으로 변환하십시오. 또는 edge detect 명령어를 사용하여 흑백 이미지를 생성할 수 있으며, 이때 뒤의 두 숫자로 결과 엣지의 거칠기를 조절할 수 있습니다.
다음으로, image data 명령어를 사용하여 이미지를 0과 1로 구성된 행렬로 변환합니다. forer 명령어를 사용하여 행렬을 푸리에 변환한 후, 행렬의 절대값을 제곱하여 결과 이미지를 확인합니다. 이 이미지는 원본 이미지에 해당하는 회절 패턴입니다. 또한, log 함수를 사용하여 이미지의 대비를 조정합니다.
마지막으로, 모델 회절 패턴을 자유롭게 유영하는 벌레로부터 얻은 회절 패턴과 비교하십시오. 본 예시에서는 가로 1cm, 두께 5mm, 높이 4cm의 석영 Q vet에서 sea elegance를 연구하였습니다. 비디오 분석을 사용하여 단일 벌레를 샘플링합니다.
5 mm 두께의 벳(vet)에서 비디오 분석을 통해 얻은 평균 수영 빈도는 약 2.5 Hz였습니다. 마찬가지로, 실시간 데이터 수집 방법과 디지털 오실로스코프를 사용하여 단일 벌레를 샘플링한 결과, 수영 빈도는 약 2.7 Hz로 나타났습니다. 이 절차는 많은 수의 벌레에 대해 반복해서 수행할 수 있습니다.
자유롭게 헤엄치는 벌레를 상세히 연구한 결과, 5 mm vete에서 평균 수영 빈도가 2.37 hertz인 것으로 나타났습니다. 예상대로 수영 빈도는 기어가는 벌레의 빈도보다 높았습니다. 이 회절법을 사용하여 현미경 슬라이드에 제한된 sea elegance의 평균 수영 빈도를 측정한 결과, 이전에 발표된 값인 2 hertz와 일치하는 것으로 확인되었습니다.
비디오의 내용에 따라, 본 비디오에서 시연된 회절 패턴의 데이터 준비 및 모델링을 통해 수영 회절 패턴을 모델링할 수 있습니다. 일반 현미경으로 얻은 벌레 이미지를 활용하여, 모델링된 회절 패턴으로 sea elegance의 수영 주기를 시뮬레이션합니다.
성공적인 모델은 수영 주파수와 일치하며 물리적으로 가능한 수영 패턴의 성공으로 구성됩니다. 벌레는 수영 주기의 끝에서 수영 주기의 시작과 동일한 형태를 유지해야 합니다. 이 기술을 숙달하면 컴퓨터 화면으로 수영 주기를 관찰하면서 고속 사진 다이어트를 사용하여 각 벌레당 1분 이내에 완료할 수 있습니다.
이 영상을 시청하고 나면, 자유 유영하는 선충을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.
이 연구는 회절 패턴을 사용하여 선충 C. elegans의 수영 행동을 분석하는 새로운 접근법을 제시합니다. 이러한 패턴의 시간적 주기성을 추적함으로써 연구자들은 3차원 환경에서 이 미세한 유기체의 이동에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
Quantitative analysis of freely swimming micro-organisms using laser diffraction enables high-throughput, real-time measurement of locomotion in three dimensions, overcoming the constraints of traditional microscopy. This approach provides robust, quantitative outputs for behavioral phenotyping and functional validation in early discovery. The method supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for neurobiology and movement disorder research pipelines.
This laser diffraction method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling quantitative behavioral analysis from early target validation through lead identification and preclinical research.