TCID50 에세이를 사용하여 바이러스 성 적정에 대한 시각적 세포 병증 효과 기반 읽기를 개선하기 위해 크리스탈 바이올렛의 사용
2022년 2월 12일
이 프로토콜은 광학 현미경 검사법과 면역 세포화학 얼룩과 비교하여 크리스탈 바이올렛을 사용하여 바이러스 성도를 시각화하는 정확하고 객관적인 접근 방식을 보여줍니다.
이 프로토콜의 목표는 바이러스 재고 적정을 생성하고 크리스탈 바이올렛 염색을 사용하여 시각화하는 것입니다. 이를 위해, 일반적인 바이러스 성 적정은 염색 다음에 입증될 것입니다. 이 적정은 생물 안전 수준 2 실험실 내의 생물 안전 캐비닛에서 7 일 동안 96 웰 플레이트에서 수행됩니다.
이를 위해, 선호하는 세포주 96웰 플레이트는 해당 매체를 이용하여 시드되고 컨할 때까지 성장하게 한다. 바이러스 재고는 900 마이크로리터의 미디어와 100 마이크로리터의 바이러스 또는 상응하는 희석을 혼합하여 10배 희석제를 사용하여 희석될 것이다. 각 튜브를 소용돌이어 미디어와 바이러스의 적절한 혼합을 보장하고 희석제에 대한 오류를 피하십시오.
감염 과정에서 플레이트의 레이아웃과 각 희석을 리드에 적어 둡니다. 감염하기 전에 PBS 의 200 마이크로 리터를 사용하여 세척하십시오. 해당 우물에 50 마이크로리터의 접종을 추가합니다.
그런 다음 7 일 동안 5 % CO2 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양하십시오. 7일 간의 인큐베이션 후 PBS 200마이크로리터를 사용하여 세척하십시오. PBS에서 PFA 웰당 50 마이크로리터를 PBS에서 4%로 추가하고 실온에서 15분 동안 배양하여 세포를 수정합니다.
인큐베이션 후, 200 마이크로리터의 PBS를 사용하여 다시 두 번 세척한 후, 물에 크리스탈 바이올렛의 웰 당 50 마이크로리터를 첨가하고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 마지막으로, 우물에서 크리스탈 바이올렛을 흡기하고 선택적으로 플레이트를 실온에서 2~5분 동안 건조하게 하거나 200마이크로리터의 물로 세척하여 시각화 전에 과도한 얼룩을 제거합니다. 그 결과, 다시 염색한 후에, 부정적인 세포는 얼룩질 것입니다.
긍정적 인 우물은 지워질 것입니다. 이 정보는 최종 바이러스 성 titer를 계산하기 위해 두 설명 된 수식 중 하나에서 사용됩니다. 각 방법을 사용하여 얻은 티터를 비교했을 때, 단사이토 화학 염색시 어떤 경우에는 크리스탈 바이올렛과 비교하여 추가 양성 우물을 검출할 수 있으며, 마찬가지로 두 염색 방법 모두 현미경 검사를 통해 시각적 평가보다 더 긍정적인 우물을 검출할 수 있음을 보여주었습니다.
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개요
본 프로토콜은 크리스탈 바이올렛 염색을 이용하여 바이러스 역가를 시각화하는 정확한 방법을 제시합니다. 또한, 이 방법을 광학 현미경 관찰 및 면역세포화학 염색법과 비교합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 바이러스학
- 세포 생물학
- 실험실 기술
배경
- 바이러스 역가 측정은 바이러스 스톡을 정량화하는 데 필수적입니다.
- 크리스탈 바이올렛 염색은 바이러스의 존재 여부를 시각적으로 나타냅니다.
- 비교 방법으로는 광학 현미경 관찰 및 면역세포화학 염색이 있습니다.
- 정확한 결과를 얻기 위해서는 적절한 희석 기술이 매우 중요합니다.
연구 목적
- 바이러스 스탁 역가 측정물을 제작합니다.
- 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 역가 측정을 시각화합니다.
- 바이러스 정량 방법의 정확성을 확보합니다.
사용된 방법
- 선택한 세포주를 96-웰 플레이트에 분주합니다.
- 바이러스 스톡의 10배 희석을 수행합니다.
- 각 희석액을 적절히 혼합하기 위해 볼텍싱합니다.
- 7일간의 배양 기간 후 크리스탈 바이올렛으로 염색합니다.
주요 결과
- 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 이용한 바이러스 역가 측정의 성공적인 시각화.
- 다른 염색 방법과의 비교를 통해 일관성을 확인하였음.
- 바이러스 스톡의 정확한 정량화를 달성하였음.
- 본 프로토콜은 향후 연구를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공함.
결론
- 크리스탈 바이올렛 염색은 바이러스 역가를 시각화하는 효과적인 방법입니다.
- 이 프로토콜은 바이러스 정량의 정확도를 높여줍니다.
- 추후 연구에서는 다양한 응용 분야를 위해 이 방법을 기반으로 발전시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
정확한 바이러스 역가 측정은 항바이러스제 스크리닝 및 백신 개발에 있어 매우 중요하며, 일관되지 않은 CPE 검출은 리드 화합물 식별 및 진행 여부 결정에 영향을 줄 수 있습니다. 크리스탈 바이올렛 염색은 면역세포화학 염색에 비해 비용 효율적이고 재현 가능한 대안을 제공하여, 분석 표준화를 개선하고 초기 발견 워크플로우의 가변성을 줄여줍니다. 이는 항바이러스 효능 평가의 예측 신뢰도를 높이며, CPE를 형성하는 바이러스에 대해 확장 가능한 고처리량 TCID50 기반 스크리닝을 가능하게 합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 바이러스 감염력을 객관적으로 정량화할 수 있게 하여 주관적인 현미경 관찰에 대한 의존도를 낮추고, 항바이러스 표적의 기전적 위험 제거(de-risking)를 지원합니다.
- 운영적 가치: 빠르고 저렴한 염색 방법을 제공하여 항바이러스 히트(hit) 검증 과정에서 분석 처리량과 재현성을 높여줍니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: TCID50 분석을 위해 명확하고 정량화 가능한 종말점을 생성하여, 화합물 스크리닝 캠페인의 신호 대 잡음비를 개선합니다.
- 운영적 가치: 고가의 ICC 시약 필요성을 제거하여 분석당 비용을 낮추고, 항바이러스제 발굴 플랫폼 전반에 걸쳐 더 광범위한 적용을 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 여러 연구에 걸쳐 일관된 바이러스 역가 측정을 제공하여, 전임상 효능 연구에서 신뢰할 수 있는 용량-반응 모델링을 지원합니다.
- 운영적 가치: 바이러스 스탁(stock) 준비의 실험실 간 표준화를 촉진하여, IND 신청 가능 연구에서 실험 간 변동성을 줄여줍니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 초기 히트 확인부터 리드 최적화에 이르는 항바이러스제 발굴 연속 과정에 적합하며, 여기서 정확한 바이러스 역가 측정은 구조-활성 관계 및 내성 프로파일링의 근거가 됩니다.
- 발견 생물학(Discovery Biology): 작용 기전 연구를 위한 재현 가능한 바이러스 챌린지 모델을 제공하여 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝(Screening): 항바이러스 스크리닝 단계에서 히트-투-리드(hit-to-lead) 진행에 필수적인 표준화되고 정량화 가능한 결과물을 제공합니다.
- 분석(Analytics): TCID50 값의 정밀한 계산을 가능하게 하여, 실험 조건 전반에 걸쳐 화합물의 효능을 정확하게 비교할 수 있게 합니다.
- 중개 연구(Translational Research): 일관된 바이러스 스톡 정량을 통해 인 비트로(in vitro) 항바이러스 스크리닝에서 인 비보(in vivo) 챌린지 모델까지의 연속성을 보장합니다.
- 기업 내 재사용(Enterprise Reuse): 다양한 바이러스 표적 및 치료 영역에 적용 가능한 확장 가능하고 비용 효율적인 역량을 나타냅니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 시각적 CPE 평가로 인한 위음성을 줄여 항바이러스 효능의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 단순화되고 표준화된 염색법을 통해 TCID50 분석의 재현성과 확장성을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 데이터 품질을 유지하면서 분석 비용을 낮추어 항바이러스 프로그램의 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: go/no-go 결정 기준에 신뢰할 수 있는 바이러스 역가 데이터를 제공함으로써 위험 조정된 추진 결정을 지원합니다.
구현 시 고려 사항
- BSL-2 환경에서 안전한 바이러스 취급을 위해 기본적인 바이러스학 교육과 무균 조작법이 필요합니다.
- 인큐베이터, 원심분리기 및 선택적 정량을 위한 플레이트 리더를 포함한 표준 실험실 장비가 필요합니다.
- 실험실 간 재현성을 보장하기 위해 염색 시간 및 세척 프로토콜에 대한 팀 간의 합의가 필요합니다.
- CPE 형성을 지원하는 부착성 세포주에 적용 가능하며, 비부착성 또는 CPE를 유도하지 않는 바이러스의 경우 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 검출 가능한 세포병성 효과를 유도하는 바이러스로 제한되며, 수정 없이는 비세포병성 또는 지속성 감염 모델에는 적합하지 않습니다.
