아가로 오스 겔 기반 Microfluidic 장치를 사용 신경 줄기 세포의 운동성 평가

안녕하세요, 코넬 대학교 Biofluids Lab의 공학 석사 과정생인 Kevin won입니다. 오늘은 agros 기반 마이크로 유체 장치를 사용하여 EGF(상피세포 성장인자)가 Maureen 신경 줄기세포에 미치는 영향을 연구하는 방법에 대해 말씀드리겠습니다.

이 장치는 기본적으로 각각 150 microns 너비의 3개 미세유체 채널로 구성됩니다. EGF는 측면 채널 중 하나로 펌핑되고, 버퍼는 다른 쪽 측면 채널로 펌핑됩니다. 이를 통해 중앙 채널을 가로지르는 정적인 선형 화학적 구배가 형성됩니다.

EGF가 아가로스 겔을 통해 쉽게 확산되므로, 신경 줄기세포를 중앙 채널에 분주하고 현미경을 통해 세포의 이동 진행 과정을 모니터링합니다. 따라서 해당 장치는 기본적으로 튜빙 연결을 위한 모든 입구와 출구가 있는 플렉시글라스 상층부와, 그 아래에 4개의 패턴 장치가 포함된 아가로스 겔 막으로 구성됩니다.

이는 PDMS 스페이서로 둘러싸여 있으며, 이를 통해 장치 전체에 걸쳐 일정한 두께가 유지됩니다. PDMS와 겔은 ect가 코팅된 유리 슬라이드 위에 조립됩니다. 이는 세포가 유리 슬라이드에 부착되도록 돕습니다.

또한, 스테인리스강 플레이트는 장치 전체를 고정하는 데 사용되며, 나사를 이용해 장치를 함께 샌드위치 구조로 조립합니다. 야생형 세포주는 야생형 EGF 수용체를 과발현시키기 위해 레트로바이러스 벡터로 형질전환되었으며, 델타 세포주는 EGF 리간드 없이도 항상 활성화 상태를 유지하는 변이된 EGF 수용체 버전으로 형질전환되었습니다. 이제 저희 마이크로 유체 장치의 조립 과정에 대해 먼저 설명하겠습니다.

먼저 마스터의 실리콘 마이크로 채널 릴리프 구조 주변에 PDMS 스페이서를 배치했습니다. 이제 agros 0.3 g을 정량하겠습니다. 이어서 CO2 독립 배지 10 mL를 취해 agros에 첨가하겠습니다.

이제 파이펫팅을 통해 agros 분말과 CO2 독립 배지를 섞어주겠습니다. 이제 전자레인지에 넣을 준비가 되었습니다. 보시는 것처럼 agros가 액상화되었지만, 아직 몇 개의 알갱이가 남아 있습니다.

알갱이를 녹이고 기포를 제거하기 위해 이를 부드럽게 돌려 섞어주겠습니다. 이제 용융된 agarose를 실리콘 마스터의 릴리프 구조 위에 붓고, 멸균된 유리 슬라이드를 가져와 PDMS 스페이서 위에 놓겠습니다. 이때 슬라이드를 비스듬히 놓아 agarose gel 내부의 기포 대부분을 밀어내어 제거합니다.

압력을 가했으며, Agarose 쉘이 굳을 때까지 계속해서 압력을 가하겠습니다. 1~2분 후에 굳었습니다. 이제 슬라이드에서 과잉의 Agarose를 제거하겠습니다.

다음 단계는 유리 슬라이드를 조심스럽게 밀어서 제거하는 것이며, 이 유리 슬라이드는 폐기해도 됩니다. 이제 미리 피브로넥틴(fibronectin)으로 코팅해 둔 유리 슬라이드로 패턴화된 하이드로젤을 조심스럽게 옮기겠습니다. 저는 기본적으로 이 플라스틱 멸균 시트를 사용하여 PDMS 스페이서와 함께 패턴화된 하이드로젤을 들어 올린 다음, 채널 면이 슬라이드를 향하도록 패턴화된 하이드로젤을 옮길 것입니다.

이제 이것이 유리 슬라이드에 단단히 고정되었으므로, 플라스틱 매니폴드가 채널에 접근할 수 있도록 개별 리저버에 구멍을 뚫겠습니다. 소형 금속 펀치를 사용하여 이 작업을 수행하겠습니다. 이제 장치에 구멍 뚫는 작업을 완료했습니다.

마이크로 채널의 건조를 방지하기 위해 CO2 독립 배지 500 µL를 추가하고, 1~2분 동안 그대로 둡니다. 1~2분 후, 과잉 배지를 제거하고 패턴 아가로즈에 뚫린 구멍을 플렉시글라스 매니폴드의 입구 및 출구 구멍에 맞춥니다. 구멍이 정렬되면, 단단히 눌러 밀봉합니다.

이제 스테인리스 스틸 마운트 위에 플렉시글라스 매니폴드를 배치하고, 나사를 사용하여 장치를 조심스럽게 고정하겠습니다. 나사를 너무 세게 조이면 채널이 눌릴 수 있으므로 주의해야 하며, 내부의 아가로스 겔 패턴이 밀려나지 않도록 시계 방향으로 나사를 조입니다. 이제 배지 1 mL를 취해 이 주사기로 장치를 테스트하겠습니다.

보시는 바와 같이, 각 마이크로채널에 액체를 주입하여 각 배출구로 액체가 나오는지 확인하고 있습니다. 현재 조립된 장치를 현미경의 환경 챔버 안에 넣은 상태입니다. 이곳은 37 °C로 유지되므로, 장치를 예열하여 세포를 파종할 준비를 갖추게 됩니다.

보시는 바와 같이, 저는 이미 두 개의 파라솔 펌프 튜브를 장치에 연결해 두었습니다. 그리고 실험 준비를 위해 현재 PBS로 튜브를 세척하고 있습니다. 이제 튜브 설정을 진행하겠습니다.

이미 구멍이 뚫려 있는 캡을 통해 파라솔 펌프 튜브를 끼우겠습니다. 각 튜브에는 특정 개수의 홈이 파여 있어 튜브의 입구와 출구를 식별할 수 있습니다. 따라서 홈이 4개 있는 튜브에 10 nanogram per mil을 주입하겠습니다.

이제 EGF 용액 튜브를 장치에 연결하겠습니다. 각 장치에 있는 홈의 개수에 맞춰 튜브를 연결하여, 장치가 흡수하는 용액과 일치하도록 하겠습니다.

이제 배출 튜빙을 연결합니다. 배지가 실제로 배출 튜빙을 통해 흐르고 있는지, 그리고 채널에 막힘이 없는지 확인하기 위해 투명한 tigon 튜빙을 사용합니다. 이제 페리스탈틱 펌프를 작동시키겠습니다.

이제 세포를 중앙 채널에 파종하는 절차를 시작하겠습니다. 먼저 센서 채널 내의 과잉 배지를 제거하겠습니다. 이제 세포를 파종하겠습니다.

세포는 이미 CO2 독립 배지 내에 부유 상태로 있습니다. 중앙 채널의 입구에 60 µL를 주입하였고, 출구에는 20 µL를 주입하였습니다. 중력 기반 흐름에 의해 세포가 안착되기를 기대합니다.

나머지 두 개의 민감한 채널에 대해서도 이 절차를 반복하겠습니다. 이제 현미경으로 관찰하여 세포 안착이 성공적으로 이루어졌는지 확인하겠습니다. 이제 세포들이 유리 슬라이드에 부착되었으며, 몇 분 후면 퍼지기 시작하여 고유의 형태를 갖추게 될 것입니다. 오늘 우리는 실제 장치의 조립, 시약의 준비, 그리고 장치 내 세포 이동을 이미지화하기 위해 제가 사용하는 현미경 기법들에 대해 다루었습니다.

결론적으로, 본 장치가 특히 임상 환경에서 훨씬 더 폭넓게 활용되기를 기대합니다. 그림 1의 가로축은 C 17.2 세포의 궤적을, 세로축은 증가하는 EGF 농도를 나타냅니다.

이는 동일한 EGF 농도에서 우리가 실험에 사용한 C 17.2 세포의 다양한 균주 궤적을 보여줍니다. 모세포 데이터는 10 ng/mL EGF 농도 구배에서 운동성이 정점에 도달함을 보여주며, 이는 더 높은 EGF 농도에서 수용체가 리간드로 포화되었음을 나타냅니다. 그리고 야생형 데이터는 100 ng/mL EGF 농도에서 운동성이 증가함을 보여줍니다.

이는 EGF 농도가 높아져도 수용체가 포화되지 않음을 나타냅니다. 이는 EGF 수용체를 과발현하도록 설계되었기 때문에 타당한 결과입니다. 마지막으로, 델타 세포주 데이터는 세포의 운동성이 EGF 농도와 거의 무관함을 보여줍니다.

변이된 EGF 수용체들은 EGF의 존재 여부와 관계없이 활성화되도록 설계되었으므로 이는 예상된 결과입니다.