저밀도 호중구의 효율적인 정제를 위한 신속한 자기-마이크로비드 방법

우리는 말초혈 단핵세포 내 저밀도 호중구를 연구하여 그 기능을 특성화하고, 이를 규명하여 다양한 질병에서 그 역할을 규명합니다. 저밀도 호중구는 건강한 혈액에서는 드물지만, 전신성 홍반성 루푸스나 암과 같은 질환에서는 현저히 증가합니다. 먼저, 15밀리리터 원뿔형 원심분리관에 항응고제로 헤파린 10단위를 첨가합니다.

그 다음 PBS에 6% 덱스트란 T500 2밀리리터를 추가하세요. 건강한 성인 자원봉사자로부터 정맥천자를 통해 10밀리리터의 혈액을 채취합니다. 또 다른 신선한 15밀리리터 원심분리관에 밀도 구배 매체 5밀리리터를 추가합니다.

적혈구를 만지지 않고 혈장을 조심스럽게 피펫으로 빼내고, 배지 위에 겹쳐 두 개의 별도 상을 만듭니다. 튜브를 516g에서 4도 섭씨에서 20분간 원심분리합니다. PBMC를 분리하기 위해, PBMC 밴드 위에서 혈장을 흡입하여 세포를 교란하지 않고 폐기합니다.

플라즈마와 배질 사이에 단핵 전지 밴드를 모아 배지 수집을 최소화합니다. PBMC 튜브에 PBS 20밀리리터를 추가한 후, 400g 원심분리기를 4도 섭씨에서 5분간 가열합니다. 상정액을 조심스럽게 흡입한 후 튜브를 긁어 펠릿을 분리하세요.

세포를 재현탁시키기 위해 차가운 PBS 10밀리리터를 추가하세요. 호중구를 분리하려면 배지를 피펫으로 빼낸 후 튜브를 긁어 세포를 분리하세요. 그 다음 차가운 PBS 10밀리리터를 추가하세요.

이제 세포를 신선한 50밀리리터 원뿔 원심분리관과 원심분리기에 옮깁니다. 상청액을 흡인하고 다시 튜브를 긁어내세요. 이제 10밀리리터의 차가운 저장액을 튜브에 피펫팅하고 부드럽게 섞습니다.

정확히 1분간 부드럽게 섞으세요. 빠르게 10밀리리터의 차가운 고장액을 추가하여 용액을 등장성으로 만듭니다. 그 후 노이바우어 챔버를 사용해 호중구를 세고 순도가 95% 이상인지 확인한다. 부유액을 원심분리하여 세포 펠릿을 얻는다.

그 후 펠릿을 차가운 PBS에 다시 현탁하세요. 말초혈 단핵세포를 400g에서 4도 섭씨에서 5분간 원심분리하세요. 상청액을 제거한 후, 세포를 120마이크로리터의 냉세척 완충제에 다시 부탁합니다.

그 후 세포 현탁액에 CD66b 자기 마이크로비드 35마이크로리터를 피펫팅합니다. 혼합물을 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 30분간 부양하세요. 이제 튜브에 1밀리리터의 콜드 워시 버퍼를 피펫팅하세요.

튜브를 400g에서 3분간 원심분리하세요. 상원액을 제거한 후 튜브를 긁어 세포 펠릿을 분리하세요. 그리고 세포를 1밀리리터의 워시 버퍼에 다시 현탁시키는 거죠.

자석 위에 자기 분리 컬럼을 올려놓으세요. 컬럼에 0.5밀리리터의 워시 버퍼를 추가하여 완전히 통과시키도록 합니다. 재현탁된 세포 1밀리리터를 컬럼에 옮기고 버퍼를 한 방울 한 방울 통과시키세요.

세척 후에는 컬럼을 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다. 그 다음 1밀리리터의 워시 버퍼를 피펫팅해 컬럼에 넣습니다. 이제 플런저를 기둥 위에 꽂으세요.

세포를 부드럽게 압박해 희석하세요. 그 다음 플런저를 제거하고 컬럼을 새로운 마이크로 원심분리기 튜브에 올려놓습니다. 컬럼에 세척 완충제를 추가해 주세요.

그 후 플런저를 다시 삽입하고 부드럽게 압력을 가해 남은 세포를 희석합니다. 두 개의 마이크로 원심분리관을 800g에서 3분간 원심분리합니다. 두 튜브에서 세포 펠릿을 1밀리리터의 차가운 PBS로 재현탁합니다.

셀 서스펜션은 얼음 보관해. 정제된 세포를 1% 태아 소 혈청으로 만든 표지 버퍼에 PBS에 재현탁합니다. 현탁액 250마이크로리터를 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 옮깁니다.

호중구막 분자에 대한 대응 항체를 튜브에 추가하세요. 그 후 세포를 빛으로부터 보호한 채 섭씨 4도에서 30분간 배양합니다. 이제 튜브에 PBS 1밀리터를 피펫팅하세요.

튜브를 800g 마이크로 원심분리기에서 3분간 돌립니다. 상액을 흡인하세요. 튜브를 톡톡 두드려 펠릿을 부수세요.

그리고 세포를 1% 파라포름알데히드 0.5밀리리터에 재현탁하세요. 그 후 세포를 4도 섭씨로 유지하며 빛으로부터 보호하다가 유세포 분석으로 분석할 때까지 보호합니다. 유세포분석을 사용하여 샘플당 10,000건의 사건을 포착합니다.

건강한 사람들의 저밀도 호중구는 말초혈 단핵세포의 약 5%를 차지했으며, 설명된 자기 격리 프로토콜은 약 98%의 회복률로 저밀도 호중구를 제공했다. 호중구는 막 표지자 CD10, CD11b, CD15, CD62L, CD66b를 발현합니다. 자기적으로 정제된 저밀도 호중구는 호중구와 동일한 막 표지를 발현합니다.

정제된 저밀도 중중구는 다엽 핵을 보였으며 호중구와 크기가 비슷했습니다. 호중구와 저밀도 호중구 모두 PMA 자극에 반응하여 활성 산소 종을 생성했으며, 저밀도 호중구가 호중구보다 높은 농도를 생성했습니다. 저밀도 호중구는 PMA 자극에 반응하여 호중구 세포외 트랩을 방출하는데, 이는 DNA와 엘라스타제 및 시트룰린의 공동 위치로 입증됩니다.

정제된 호중구와 저밀도 호중구 모두 PMA 처리 후 유사한 동역학과 양의 NET를 방출했습니다. 우리 프로토콜은 고순수하고 기능성 높은 저밀도 호중구를 빠르고 재현 가능하게 얻는 방법을 제공합니다. 우리는 인간 혈액에서 저밀도 호중구를 분리하기 위한 표준화되고 시간 효율적인 프로토콜의 부재를 다룹니다.

이 프로토콜은 복잡한 기기에 대한 특별한 교육이 필요하지 않으며, FACS보다 경제적이고 빠릅니다.