Het verwerken van de Loblolly Pine PtGen2 cDNA microarray
20 maart 2009
Het cDNA microarray PtGen2 is ontwikkeld voor genexpressie studies in loblolly pine, P. taeda, En andere naaldbomen. Hier tonen we pre-en post-hybridisatie hanteren en wassen technieken die gebruikt kunnen worden met deze array betere consistentie, verminderde artefacten, en een lagere opbrengst achtergronden.
Deze video is geproduceerd door onderzoekers van de Warnell School of Forestry and Natural Resources aan de University of Georgia. Het doel van deze trainingsvideo is om gedetailleerd uit te leggen hoe onze LOB lolly pine pt, gen twee CDNA-microarray moet worden verwerkt, met bijzondere aandacht voor het wassen en hanteren van de array, zowel vóór als na hybridisatie. In het algemeen volgen onze protocollen die van het Institute for Genomic Research Tiger en de Vanderbilt Microarray Shared Resource Facility (VMSR), waar onze arrays worden geprint.
We hebben vastgesteld dat een striktere verwerking van PT Gen twee vereist is om de grootste consistentie te verkrijgen met betrekking tot de uniformiteit van de signaalkwaliteit en lage achtergronden. De eerste stap is een pre-wash. We doen dit omdat onze spottingbuffer een zeer hoog zoutgehalte bevat en deze pre-wash noodzakelijk is om dat zout te verwijderen.
De objectglazen worden in een objectglashouder geplaatst en 15 tot 20 keer krachtig ondergedompeld in een 0,2% SDS-oplossing die is voorverwarmd tot 43 °C. Nadat de objectglazen in de SDS-oplossing zijn gewassen, worden ze voorzichtig met een pincet overgebracht naar een Copeland-pot met prehibridisatiebuffer. Deze buffer bevat 5X SSC, 0,1% SDS en 1% BSA, en is eveneens verhit tot 43 °C.
De Copeland-pot wordt bedekt met parfum en gedurende één uur in een incubator van 43 °C geplaatst. Na de prehybridisatie worden de objectglazen overgebracht naar een objectglashouder en opeenvolgend behandeld met vijf wisselingen van gedeïoniseerd water, waarbij ze 15 tot 20 keer in elke wisseling worden gedompeld. Ten slotte worden de objectglazen in isopropanol geplaatst en vijf of zes keer gedoopt voordat ze in een chip M mate-centrifuge worden gecentrifugeerd tot ze droog zijn.
Na centrifugatie worden de objectglazen afgeblazen met perslucht die door een filter van 0,2 micron is geleid. De objectglazen worden vervolgens bedekt met dekglasplaatjes, die eveneens met perslucht zijn gereinigd, waarna we een kleine pipetpunt gebruiken om het dekglasplaatje in de juiste positie op het objectglas te plaatsen.
Nadat de lifter slips zijn geplaatst, maar voordat de hybridisatiebuffer wordt toegevoegd, voegen we 20 µL van 100 mM dihi, drie atol toe aan de bevochtigingsputjes aan de uiteinden van de kamer. Nu zijn we klaar om de target cDNA's toe te voegen, die zijn geresuspendeerd in hybridisatiebuffer. De pipetpunt wordt aan de rand van de lifter slip en de slide geplaatst en de oplossing wordt langzaam gepipetteerd.
We stelden vast dat het benutten van het capillaire effect bij het laden van de arrays de meeste consistentie biedt en de vorming van ongewenste luchtbellen aanzienlijk vermindert. Nadat het doelmateriaal aan de array is toegevoegd, wordt de hybridisatiekamer geassembleerd en afgedekt met aluminiumfolie. De hybridisatiekamer wordt vervolgens in een schuddend waterbad geplaatst voor incubatie gedurende de nacht, gewoonlijk 14 tot 16 uur.
Het waterbad wordt ingesteld op 48 °C en de shaker op 50 rpm. Het is bovendien belangrijk om op te merken dat vanaf het moment van toevoegen van de hybridisatieloplossing tot en met alle wasstappen na de hybridisatie, de procedures bij weinig licht worden uitgevoerd om foto-oxidatie te voorkomen. De volgende dag worden de objectglazen uit de hybridisatiekamer gehaald en geplaatst in een Copeland-pot met wasoplossing nummer één, die vooraf is voorverwarmd tot 53 °C.
De objectglazen blijven ongeveer een minuut in de Copeland-pot tot de liftstrips loslaten, waarna de glazen voorzichtig met een pincet worden verwijderd en in een objectgashouder worden geplaatst om verder te gaan met de wasstappen. De objectglazen worden vervolgens ongeveer 15 tot 20 keer krachtig ondergedompeld in een tweede container, die eveneens wasoplossing nummer één bij 53 °C bevat. De container wordt daarna afgesloten met Parafilm en geplaatst in een incubator-schudapparaat dat is ingesteld op 53 °C en 100 RPM.
Na de incubatie van 10 minuten en wasoplossing nummer één worden de objectglazen 15 tot 20 keer krachtig ondergedompeld in een container met wasoplossing nummer twee, die op kamertemperatuur is. De container wordt afgedekt met parafilm en opnieuw op een shaker bij kamertemperatuur geplaatst voor een incubatie van 10 minuten. Ten slotte worden de objectglazen uit wasoplossing nummer twee gehaald en 15 tot 20 keer krachtig ondergedompeld in een container met wasoplossing nummer drie.
De objectglazen worden vervolgens overgeplaatst naar een tweede bak met wasoplossing nummer drie, afgedekt met Parafilm, en opnieuw 10 minuten op de schudmachine geplaatst. Na de laatste wasstap centrifugeren we de objectglazen tot ze volledig droog zijn. Hiervoor plaatsen we een dop van een 15 ml Falcon-buis in een 50 ml conische buis en plaatsen we de arrays met de barcodezijde naar beneden in de conische buis.
De buisjes worden vervolgens gecentrifugeerd in een swing-out rotor op 1500 RPM bij kamertemperatuur. Na centrifugatie worden de objectglazen overgeplaatst naar een tweede set conische buisjes van 50 mil, die zijn afgedekt met aluminiumfolie. De buisjes worden vervolgens gespoeld met stikstofgas, dat is gefilterd door een 0,22 micron filter, en afgesloten voor transport of opslag tot aan het scannen.
We verzamelen scandata op een PerkinElmer scan array 5, 000. De array-afbeelding wordt gerasterd, de ruwe scandata worden verwerkt en de initiële data-analyse wordt uitgevoerd met de imaging software suite van BioDiscovery. Vervolgens worden de signaalintensiteitsgegevens van de spots genormaliseerd en worden statistische analyses uitgevoerd met BRB array tools, een robuust en gratis beschikbaar statistisch microarray-pakket dat kan worden gedownload van het National Cancer Institute.
Andere statistische analyses en zoekopdrachten naar genexpressiepatronen worden uitgevoerd met de suite voor genexpressiepatronen en analyses Jeep PPAs, een ander freely beschikbare webgebaseerde analysepackage. Bedankt voor het bekijken van onze video over het verwerken van de loblollyden PT Gen twee microarray.
De volgende personen waren verantwoordelijk voor de inhoud en productie van deze trainingsvideo.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert de cDNA-microarray PtGen2, ontwikkeld voor genexpressiestudies bij loblollyden en andere coniferensoorten. Het beschrijft in detail de technieken voor de behandeling en het wassen vóór en na de hybridisatie om de consistentie te verbeteren en artefacten te verminderen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Genexpressieanalyse
- Microarray-technologie
- Plantbiologie
Achtergrond
- cDNA-microarrays zijn essentieel voor het bestuderen van genexpressie.
- PtGen2 is specifiek ontworpen voor de loblollyden en coniferen.
- Correcte hanteertechnieken zijn cruciaal voor betrouwbare resultaten.
- Het hoge zoutgehalte in de spottingbuffer maakt voorwassen noodzakelijk.
Doel van de studie
- Om de consistentie van genexpressiegegevens te vergroten.
- Om achtergrondruis in microarray-resultaten te verminderen.
- Om een gestandaardiseerd protocol voor onderzoekers te bieden.
Gebruikte methoden
- Voorwas om zout uit de spottingbuffer te verwijderen.
- Stringente wastechnieken na hybridisatie.
- Vergelijking met protocollen van erkende onderzoeksinstituten.
- Evaluatie van de signaalkwaliteit en achtergrondniveaus.
Belangrijkste resultaten
- Er is een verbeterde consistentie in de signaalkwaliteit waargenomen.
- Lagere achtergrondniveaus zijn bereikt met verfijnde technieken.
- Protocollen hebben hun effectiviteit aangetoond in meerdere experimenten.
- Aanbevelingen voor toekomstige studies zijn verstrekt.
Conclusies
- Verbeterde hanteer- en wastechnieken zijn essentieel voor het succes van microarrays.
- Gestandaardiseerde protocollen kunnen leiden tot betrouwbaardere gegevens over genexpressie.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen voor betere resultaten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit protocol richt zich op een belangrijke uitdaging in de plantgenomica: het verkrijgen van reproduceerbare microarray-gegevens ondanks het gebruik van spotting-buffers met een hoog zoutgehalte, die artefacten kunnen veroorzaken. Door de wasstappen vóór en na de hybridisatie te standaardiseren, verbetert deze methode de consistentie van de gegevens en wordt de achtergrondruis verminderd, wat betrouwbare genexpressieprofilering in naaldboomsoorten ondersteunt. Dit draagt bij aan inspanningen voor targetvalidatie in de bosbouwbiotechnologie door een duidelijkere detectie van differentieel tot expressie gebrachte genen onder experimentele omstandigheden mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar transcriptionele responsen in coniferenweefsels mogelijk, wat hypothesetesten in stress- of ontwikkelingspaden ondersteunt.
- Operationele waarde: Vermindert technische variabiliteit door zoutartefacten, waardoor het vertrouwen in de identificatie van doelwitten wordt vergroot.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gestandaardiseerde microarray-dia's met een lage achtergrond, geschikt voor reproduceerbare hybridisatie over verschillende experimentele groepen.
- Operationele waarde: Vestigt een robuuste workflow voor de preparatie van dia's die de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de assay verbetert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door betrouwbare expressieprofielen van dennenweefsels te leveren, wat nuttig is bij het bestuderen van omgevingsaanpassing of houtvorming.
- Operationele waarde: Vergemakkelijkt de vergelijkbaarheid tussen studies door consistente verwerking van coupes, wat bijdraagt aan translationele continuïteit.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen de workflow voor discovery biology en ondersteunt specifiek betrouwbare targetprofilering in niet-modelplantensystemen waarin genetische tools beperkt zijn.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesegestuurde expressieanalyse in de loblollyden mogelijk, waardoor genresponsen in wortel-, naald- en stamsystemen worden verduidelijkt.
- Screening: Levert microarray-dia's met een uniforme signaalkwaliteit, wat betrouwbare vergelijkende screening van genexpressie onder verschillende omstandigheden mogelijk maakt.
- Analytica: Genereert zuivere, genormaliseerde signaalintensiteitsgegevens die compatibel zijn met downstream-tools zoals BRB Array Tools en JePPAs voor statistische analyse.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de continuïteit van genontdekking naar functionele validatie door het leveren van betrouwbare expressiebaselines.
- Herbruikbaarheid op bedrijfsniveau: Stelt een herbruikbaar protocol voor dia-preparatie vast dat kan worden toegepast op meerdere conifeersoorten en experimentele ontwerpen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert het voorspellend vertrouwen in genexpressiemetingen door artefacten afgeleid van zout en SDS te minimaliseren.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid tussen slides en laboratoria door middel van gedefinieerde was- en handelingenstappen.
- Strategische waarde: Vermindert het risico op fout-positieven/negatieven bij expressieprofilering, wat betere go/no-go-beslissingen bij targetvalidatie ondersteunt.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaatgenen mogelijk op basis van schonere, betrouwbaardere expressiegegevens.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de hantering van microarrays en hybridisatietechnieken.
- Toegang tot temperatuurgecontroleerde waterbaden, incubatoren en centrifuges voor de verwerking van slides is noodzakelijk.
- Vereist gestandaardiseerde reagentia, waaronder SDS, SSC, BSA en isopropanol voor het wassen en dehydrateren.
- Aanpassing van de luchtvochtigheidsregeling en de hybridisatietijd is vereist, afhankelijk van de bron van het doel-RNA en de labelingsmethode.
- Praktische beperking: De spottingbuffer met een hoog zoutgehalte vereist grondig preventief wassen; onvolledige zoutverwijdering kan aanhouden als stappen worden ingekort.
