Een kwantitatieve beoordeling van de gist Lipidome met behulp van electrospray ionisatie massaspectrometrie

Dit protocol maakt het mogelijk om snel de belangrijkste componenten van de lipidenpool van gist te analyseren. Het begint met het oogsten en wassen van gistcellen. De gewassen cellen worden geplaatst in een mengsel van chloroform en methanol in een verhouding van één op twee en vervolgens gelyseerd met glaskralen.

Toevoeging van chloroform en water scheidt de twee fasen. De organische fase wordt verzameld en gedroogd, waarna de lipidefilm wordt opgelost in chloroform voor bewaring voorafgaand aan massaspectroscopie. De geëxtraheerde lipiden worden verdund in chloroform en methanol met ammoniumhydroxide, waarna een mengsel van interne standaarden wordt toegevoegd.

De lipide-oplossing kan nu direct in de massaspectrometer worden geïnjecteerd. Hallo, ik ben Simon Bork van het laboratorium van Vladimir Teco van de afdeling Biologie van de Concordia University. Vandaag ga ik u een methode laten zien voor het kwantificeren van gistlipiden met behulp van massaspectroscopie.

We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om veranderingen in de lipiden van gist onder verschillende groeicondities te bestuderen. Laten we beginnen. Om deze procedure te starten, resuspendeert u de eerder bereide bevroren gistpellets in 1,6 milliliters ijskoud gedestilleerd water en brengt u 1,6 milliliters van de celsuspensie over naar glazen centrifugebuisjes voor hoge snelheden.

Let op dat alle handelingen met geëxtraheerde lipiden gedurende deze procedure worden uitgevoerd met glazen pipetten of spuiten. Omdat plastics een groot achtergrondsignaal veroorzaken wanneer ze in contact komen met chloroform, start u de lipidextractie door zes milliliter van een chloroform-methanolmengsel in een verhouding van één op twee en 0,8 milliliter glazen kraaltjes, afgemeten in een eppendorfbuis, toe te voegen aan de celsuspensie. De exacte volumes zijn niet kritisch, zolang de verhouding van één op twee op 0,8 voor chloroform, methanol en gist gesuspendeerd in water wordt aangehouden. Vortex.

De celsuspensie en glasparels worden twee keer gedurende één minuut gemengd, gevolgd door het toevoegen van twee milliliters chloroform en voorzichtig mengen, waarna er vijf minuten wordt geïncubeerd bij kamertemperatuur met af en toe mengen. Na de incubatie van vijf minuten worden twee milliliters gedestilleerd water toegevoegd en voorzichtig gemengd. Vervolgens wordt er opnieuw vijf minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur met af en toe mengen.

Ook hier is het belangrijker om de verhouding van 2:2:1,8 voor chloroform, methanol en water te handhaven dan een specifiek volume. Wanneer de tweede incubatie is voltooid, wordt er vijf minuten gecentrifugeerd bij 3000 Gs bij kamertemperatuur. Verzamel alle supernatant van deze eerste extractie in een nieuwe glazen centrifugebuis voor hoge snelheden en voeg 3,2 milliliters chloroform toe aan de overgebleven celpellets voor een tweede lipidextractie.

Vortex de celpellets met het toegevoegde chloroform twee keer gedurende één minuut per keer. Centrifugeer vervolgens vijf minuten bij 3000 Gs. Voeg bij kamertemperatuur het supernatant van deze tweede extractie toe aan het supernatant dat na de eerste extractie is verzameld. Centrifugeer daarna de verzamelde supernatanten vijf minuten.

Na centrifugatie bij 3000 Gs bij kamertemperatuur zijn de geëxtraheerde lipiden nu opgelost in de onderste organische fase. Verwijder de bovenste waterige fase en breng de onderste fase over in een nieuwe glazen centrifugebuis voor hoge snelheden. Om schonere spectra op de massaspectrometer te verkrijgen, wordt de organische fase gedurende vijf minuten gecentrifugeerd bij 3000 Gs bij kamertemperatuur, waarna het volledige supernatant in een glazen vial wordt overgebracht.

Droog de opgeloste lipiden onder stikstof, los de gedroogde lipidfilm op in 500 µL chloroform en bewaar dit bij -20 °C tot de monsters klaar zijn voor analyse via massaspectrometrie. Begin met het bereiden van een standaardmix van de lipiden in chloroform, zoals vermeld in tabel 1 in het bijbehorende geschreven protocol. Elk lipide vertegenwoordigt een andere klasse.

Deze oplossing kan bij min 20 °C worden bewaard voor later gebruik, voorafgaand aan de injectie van de geëxtraheerde lipiden in de massaspectrometer. Combineer 10 µL van het monster met 10 µL van de standaardmix lipiden. Let op dat de verhouding tussen standaard en monster naar behoefte kan worden aangepast.

Scheid de mengsels van monster- en standaardlipiden met behulp van een micro mass Q-to-F twee massaspectrometer, uitgerust met een nano-electrospraybron die werkt bij een stroomsnelheid van 1 µL/min. De instellingen zijn gedetailleerd in tabel 2 van het bijbehorende geschreven protocol. Hoewel het gebruik van de hoge resolutie van een Q-to-F massaspectrometer voordelig is, is dit geen verplicht vereiste.

De exacte instrumentparameters variëren per massaspectrometer. Na de gegevensverwerving worden de massaspectra gladgestreken, wordt de achtergrond afgetrokken en worden de pieken gecentreerd. Exporteer tot slot de pieklijst naar Excel.

Normalise vervolgens de pieken van elk lipidestract naar hun interne standaard. Afhankelijk van de toepassing kan het noodzakelijk zijn om verdere nabewerking uit te voeren, zoals het verwijderen van isotopen en deconvolutie. Deze methode maakt een snelle, diepgaande bepaling van de belangrijkste componenten van het lipidoom van de gist mogelijk.

Hier hebben we één lipide gemarkeerd, waarvan de isotopen zijn gedevolueerd en genormaliseerd ten opzichte van de interne standaard. We hebben zojuist aangetoond hoe gistlipiden te isoleren en hoe de gistlipiden te bepalen met behulp van electrospray-ionisatiemassaspectrometrie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het gebruik van plastics te vermijden en uw monster binnen het lineaire concentratiebereik te houden.

Deze methode is vrij flexibel en in veel gevallen kunnen de volumes naar behoefte worden aangepast. Dit extractieprotocol is ook geschikt voor andere methoden van lipidenanalyse, zoals dunne-laagchromatografie en multidimensionale massaspectroscopie. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.