Kwantificering van eiwitten met behulp van immuno-peptide Verrijking gekoppeld aan massaspectrometrie

Het algemene doel van de volgende procedure is het isoleren en kwantificeren van peptiden in een complex mengsel die dienen als surrogaat voor hun respectieve eiwit. Eerst worden grote eiwitten binnen het mengsel verteerd tot componentpeptiden met behulp van een enzym zoals trypsine. Vervolgens worden de doelwitpeptide-analieten en een toegevoegde, met een stabiel isotoop gelabelde interne standaard verrijkt met behulp van anti-peptide-antilichamen, die na isolatie zijn geïmmobiliseerd op magnetische deeltjes gecodeerd met proteïne G.

De doelleptiden worden geëlueerd van de magnetische partikels en geanalyseerd via massaspectrometrie voor kwantificering ten opzichte van de interne standaard. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals traditionele immunoassays, zijn dat deze sneller is en kosteneffectiever bij het opzetten van een groot aantal assays. De methode heeft een hoog succespercentage en is eenvoudig te multiplexen, zoals in de beschreven procedure zal worden uiteengezet.

Een laborant heeft 10 µL plasma op nat ijs. Breng de monster naar een 1000 µL deep well plate en dek deze af met Parafilm. Denatureer de eiwitten door 20 µL verse 9 M ureum en 30 mM DTT aan elk monster toe te voegen en 30 minuten te incuberen bij 37 °C. Voeg 3 µL verse 500 mM iodoacetamide toe aan elk monster en incubeer 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Verdun vervolgens het ureum tot 0,6 M met 100 mM tris pH 8 en voeg 10 µL van een 1 µg/µL trypsine-stockoplossing toe voor een enzym-substraatverhouding van 1:50.

Na het overnacht incuberen van de reactie bij 37 °C met drie µL pure mierenzuur tot een eindconcentratie van 1%, wordt het stabiele isotopenstandaard of meerdere standaarden toegevoegd. Bij het uitvoeren van een multiplex-assay wordt de Oasis-cartridgeplaat goed gewassen met 500 µL 0,1% mierenzuur in 80% ACE-acetonitril, waarbij de doorloop wordt weggegooid. Equilibreer vervolgens de cartridgeplaat door 500 µL 0,1% mierenzuur in water toe te voegen en gooi de doorloop weg.

Breng de digestie-monsters aan op de cartridgeplaat en stel het vacuüm zo in dat de doorstroom zeer traag is. Was drie keer met 500 µL 0,1% mierenzuur in water en verwijder het doorstroomvolume. Elueer de peptiden twee keer met 500 µL 0,1% mierenzuur in 80% acetonitril, liofiliseer vervolgens het eluaat of gebruik een SpeedVac om het tot droogte in te brengen, en reconstitueer de gedroogde peptiden in 50 µL PBS plus 0,03% Chaps. Draag de monsters over naar een standaard Kingfisher 96-wellplaat en voeg per target één µg antilichaam en 1,5 µL met proteïne G gecoate magnetische beads toe. Vortex de beads vóór toevoeging.

Om ervoor te zorgen dat de beads goed gesuspendeerd zijn, wordt de plaat afgedekt met folie en overnacht geïncubeerd in een centrifuge met zachte tumbling-functie. De plaat wordt 10 seconden lang op 400 RPM gecentrifugeerd om eventuele vloeistof van het folieoppervlak te verwijderen.

Verwijder de folieafdekking. De monsterbewerking vindt plaats op een geautomatiseerd Kingfisher-platform. Was de beads twee keer met 200 µL PBS plus 0,03% chaps en één keer met 200 µL van een 1:10 verdunning van PBS plus 0,03% chaps; elueer vervolgens de peptiden met 25 µL van 5% azijnzuur plus 0,03% chaps.

Plaats de elutieplaat op een magneet en breng het eluaat over naar een 96-wells plaat, waarbij u er zorg voor draagt dat de resterende kraaltjes niet worden overgebracht. Dek de plaat af met de plafondmat en lever deze plaat met het eluaat af bij de triple- of quadruple massaspectrometer voor analyse. De MRM-methode wordt opgesteld door een tandemmassaspectrum van het peptide van belang te verkrijgen en vervolgens de beste transitiefragment-ionen te selecteren en te optimaliseren.

Doorgaans maakt een configuratie voor MRM-analyse gebruik van een C 18 trap- en analytische kolom met twee mobiele fasen. Load 10 µL van het monster en elueer via een lineair gradiënt. Integreer de piekgebieden voor de lichte en zware peptiden en bereken de verhouding van het piekgebied van ongelabelde ten opzichte van gelabelde peptiden in elk monster.

De lichte en zware peptiden elueren op hetzelfde moment en voor elk peptide kunnen meerdere transities worden gemonitord. Om de identiteit te bevestigen, wordt de piekoppervlakte van het endogene peptide gemeten ten opzichte van de oppervlakte van de interne standaard om een kwantitatieve maat voor het doelpeptide te verkrijgen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u deze techniek in uw laboratorium kunt implementeren. Het kan worden gebruikt om elk eiwit van belang te kwantificeren, waardoor het geschikt is voor een breed scala aan toepassingen in biologisch onderzoek.