Bloedplaatjes adhesie en aggregatie Onder Flow met behulp van Microfluïdische Flow Cellen

Het Bio Flux-systeem is een geautomatiseerd instrument en microfluïdisch apparaat voor het uitvoeren van levende celassays onder gecontroleerde schuifspanning. Dit systeem maakt gebruik van microfluïdische wellplate-technologie om flowcell-apparaten op micronschaal te integreren in SBS-standaard wellplates. BioFlex kan worden gebruikt voor het uitvoeren van studies naar plaatjesadhesie en -aggregatie met een hoge doorvoer en gereduceerde bloedvolumes.

Volbloed gelabeld met fluorescerende kleurstof wordt aan de wells toegevoegd en vervolgens door de kanalen geleid. Onder gecontroleerde schuifspanning worden microscopiegegevens met een hoge resolutie gegenereerd, waarmee de adhesie en aggregatie van bloedplaatjes in de aanwezigheid van geneesmiddelen en andere variërende parameters worden gekwantificeerd. Hallo, ik ben Mike Schwartz van het RD-lab bij Flexion Biosciences.

Vandaag laten we u een procedure zien voor het gebruik van microfluïdische stroomcellen in bloedplaatjesadhesie-assays. Wij gebruiken dit protocol in ons laboratorium voor diverse assays binnen de vasculaire biologie. Laten we beginnen.

Voordat het flowcell-experiment wordt uitgevoerd, moeten de microfluïdische kanalen van de BioFlux-plaat worden geprepareerd met een proteïnecoating naar keuze; in dit experiment wordt collagen one gebruikt. Elk van de 24 experimentele kanalen van de BioFlux-plaat is verbonden met een inlaatputje en een uitlaatputje van deze plaat. Het inlaatputje is het linkerputje dat het kanaal voedt en het uitlaatputje bevindt zich aan de rechterkant. Verdun de collagen one-stockoplossing tot een concentratie van 200 µg/mL.

In 0,02 molaire azijnzuur zijn 20 µL nodig voor elk gebruikt kanaal. Aangezien dit experiment 11 kanalen vereist, dient er 200 µL collageencoating te worden gemaakt. Eén kanaal blijft ongecoat, gemengd door voorzichtig te itereren met een micropipetpunt.

Voeg met een micropipet 20 µL coating toe aan elk respectievelijk kanaal door de vloeistof in de binnenste punch van de well te dispenseren. Vul het betreffende microfluïdische kanaal, zoals hier getoond met de gele kleurstof; neem één kanaal zonder collageen op als negatieve controle voor plaatjesadhesie en -aggregatie. Nadat de collageencoating aan alle respectievelijke kanalen is toegevoegd, bevestigt u de interface aan de plaat.

Als u de bio flux 1000-interface gebruikt, kunt u beide vergrendelingen op het objectplateau vastklemmen. Als u de Bio flux 200-interface gebruikt, draait u eerst de vier schroeven aan. Zodra deze allemaal zijn ingesteld, gebruikt u de momentsleutel om ze volledig vast te draaien.

De momentsleutel zal klikken wanneer het maximum is bereikt. Pas met behulp van de handmatige modus in de bio flux-software perfusie toe op de kanalen van belang met 2D per vierkante centimeter vanaf de uitlaat. Gebruik een objectief met lage vergroting op een microscoop om de inlaatput te vinden en observeer hoe de tegenoverliggende binnenste pons met vloeistof wordt gevuld.

U zou eerst een klein beetje vloeistof moeten zien die na enkele minuten langzaam de binnenste punch vult; zodra de binnenste inlaatpunch is gevuld, stopt u de infusie op alle kanalen door op stop te klikken in de software. Incubeer de plaat gedurende één uur bij kamertemperatuur. Tijdens deze incubatieperiode kunt u beginnen met het voorbereiden van het volbloed aan het einde van het uur durende incubatieproces.

Zodra het bloed is geprepareerd, verwijdert u de interface en voegt u één milliliter PBS met calcium- en magnesiumionen toe aan de uitlaatput. Start de perfusie vanaf de uitlaatput bij twee dynes per centimeter kwadraat en ga voort met de perfusie gedurende 10 minuten. Stop na 10 minuten de perfusie. Verwijder na het weghalen van de interface het overtollige PBS uit zowel de inlaat- als de uitlaatputten.

Verwijder nooit vloeistof die de binnenste pons vult. Om de kanalen te blokkeren, voegt u één milliliter blokkeeroplossing toe aan elke uitlaat. De te gebruiken well wordt geperfuseerd vanaf de uitlaatwell met 2 dl/cm² en de perfusie wordt 10 minuten voortgezet.

Stop de perfusie na 10 minuten en verwijder de interface. De kanalen zijn nu gereed en kunnen gedurende de dag worden gebruikt terwijl de plaat met collageen wordt gecoat. Tijdens een incubatie van één uur moet vers menselijk bloed van een nuchter persoon worden voorbereid voor beeldvorming en doorstroming door de plaat.

Bloed dient te worden afgenomen in natriumcitraat als antistollingsmiddel en binnen drie uur na collectie te worden gebruikt. Voeg eerst een 4 mM voorraadoplossing van calcium M in DMSO toe aan het bloed in een verdunning van 1:1000 volume per volume. Om een concentratie van 4 µM calcium te verkrijgen, wordt het mengsel door voorzichtig omkeren gemengd.

Dispense vervolgens één milliliter van het met calcium gelabelde bloed in tien microbuizen van 1,5 milliliter. Voeg aan elke buis GP2B3a-inhibitorantilichaam toe in de gewenste verdunning. Zorg ervoor dat er een negatieve controle zonder antilichaam en een positieve controle met een niet-gerelateerd antilichaam worden opgenomen, gemengd door voorzichtig om te keren.

Incubeer de buizen gedurende één uur bij kamertemperatuur en meng deze elke 10 minuten door voorzichtig om te keren voordat het flowcel-experiment wordt uitgevoerd. Er moet een geautomatiseerd protocol worden ingesteld in de bio flux-controlemodule voor collageen.Ten eerste: stel een protocol in om het bloed gedurende 10 minuten met tien negen centimeter vierkante vanuit de uitlaat te laten lopen.

Vervolgens moeten de parameters voor de gegevensverwerving van het BioFlex 1000-werkstation worden ingesteld, waaronder de gewenste platformposities, de verwerving in de fitz-golflengte en de time-lapse-instellingen. Een typisch beeldverwervingsplan voor dit protocol zou bestaan uit één gezichtsveld per kanaal, vastgelegd met een 10 x objectief elke 30 seconden over een totale duur van 10 minuten. Aanvullende gezichtsvelden en alternatieve time-lapse-instellingen zijn eveneens mogelijk.

Zodra het geautomatiseerde protocol en de parameters voor de gegevensverwerving zijn ingesteld, keert u terug naar de BioFlex-plaat en verwijdert u de vloeistof aan beide zijden van het kanaal, behalve bij de binnenste ponsgaten. Plaats, terwijl u er op let dat u snel werkt, 500 µL bloed van elke conditie in de outputwells van elk kanaal. Let op dat de outputwells worden gebruikt om het bloed toe te dienen, omdat dit de kortste route naar de observatiezone is en een snellere reactie van het bloed op de collageencoating mogelijk maakt.

Plaats daarnaast het controlebloed zonder antilichaam in een kanaal dat is gecoat met collageen en in een kanaal dat enkel is geblokkeerd. Plaats de plaat op de BioFlex 1000 workstation-microscoop en klem deze vast op de interface. Voer de kalibratie van de objectlijst uit door het eerste kalibratiepunt te bepalen, dat is gedefinieerd als de oorsprong.

Lokaliseer vervolgens het tweede kalibratiepunt en markeer dit. Pas deze kalibratie toe op de betreffende lijst met stadia. Dit zorgt ervoor dat alle bekijkingslocaties op de plaat automatisch kunnen worden gevonden.

Verplaats de tafel naar een van de kanalen met bloed en stel de parameters voor beeldvastlegging, zoals de belichtingstijd en gain, in de BioFlex montage-software in. Start de betreffende workflow door op de gewenste knop te klikken. Hiermee worden het flowprotocol en de beeldacquisitie gelijktijdig gestart.

Verwijder aan het einde van het experiment de plaat uit het BIOFLU 1000-workstation en voer deze af volgens de institutionele richtlijnen. Er wordt gebruikgemaakt van met collageen gecoate microfluïdische kanalen van het BioFlux-systeem. In de onbehandelde controle-bloedmonsters wordt na verloop van tijd een agressieve trombusvorming waargenomen.

In contrast is er geen trombusvorming waargenomen bij het ongecoate kanaal. In een recent uitgevoerd experiment was de gemiddelde grootte van aggregaten onder controlecondities 2000 micrometer squared. GP IIb3a is een potente mediator van interacties tussen bloedplaatjes en de stabilisatie van aggregatie wanneer deze wordt geactiveerd door adhesie aan collageen, zoals hier getoond; na incubatie met anti-GP IIb3a-antilichaam gedurende één uur voorafgaand aan de blootstelling aan shear, is een afname in de grootte van trombi alsoverwel een afname in de frequentie van trombusvorming waargenomen.

Een dosisafhankelijke respons kan doorgaans worden waargenomen bij 10 dyne cm⁻² en de IC₅₀-waarde voor deze specifieke remmer was 17 nanomolar. De maximale remming voor deze donor vergeleken met de controle zonder antilichaam was 11% bij 10 dyne cm⁻². Er is ook een 48-wells high-shear plaat beschikbaar voor het uitvoeren van experimenten met volbloed tot 200 dyne cm⁻² of 5.000 s⁻¹.

We hebben zojuist aangetoond hoe microfluïdische stroomkanalen kunnen worden gebruikt om fysiologisch relevante experimenten in de vasculaire biologie uit te voeren. Bij het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk om eraan te denken het collageen te verdunnen in de juiste buffer. Gebruik altijd de juiste pipetteertechniek om het ontstaan van luchtbellen te voorkomen en volg altijd de biosafety-voorschriften van uw laboratorium.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.