Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

Hallo en welkom bij de Membrane Structural and Functional Biology Group. Mijn naam is Martin Caffery. De focus van ons onderzoek ligt op het biologisch membraan, waarvan het schema op de eerste dia wordt getoond; het membraan dat de cel en, indien aanwezig, subcellulaire organellen omringt, is een moleculair dunne structuur, slechts twee lipidemoleculen dik en bezet met eiwitten.

Wij zijn geïnteresseerd in de structuur en functies die van toepassing zijn op zowel lipiden als eiwitten. Voor deze JO-serie zal ik mijn focus echter beperken tot membraaneiwitten. Wij streven ernaar te begrijpen hoe deze membraaneiwitten op moleculair niveau functioneren om twee redenen.

Ten eerste is er de intellectuele voldoening van het weten hoe iets werkt. Ten tweede is er, net als bij uw fiets of auto, door te weten hoe het werkt de mogelijkheid om het te repareren als het defect raakt. Geneesmiddelenontwerp is een voor de hand liggend resultaat van dit type werk.

De aanpak die wij hanteren om te achterhalen hoe een membraaneiwit op moleculair niveau functioneert, is het bepalen van de kristallografische structuur ervan. Dit houdt in dat de positie in de driedimensionale ruimte van alle atomen, of op zijn minst alle niet-waterstofatomen die het eiwit vormen, wordt vastgesteld. De methode die we hiervoor gebruiken wordt macromoleculaire röntgendiffractie genoemd, afgekort als MX.

Hier zien we een voorbeeld van een membraaneiwit waarvan de structuur is bepaald met MX; voor MX is een kristal van het eiwit van een bepaalde kwaliteit vereist. Zoals u zich kunt voorstellen, zijn er veel stappen betrokken bij structurele bepaling met behulp van macromoleculaire kristallografie, zoals hier geïllustreerd. Deze omvatten doorgaans het identificeren van een membraaneiwit-doelwit en vervolgens het produceren, zuiveren en kristalliseren ervan.

Diffractiemetingen worden op het kristal uitgevoerd met behulp van een eigen röntgenbron of een synchrotron-röntgenbron. De diffractiegegevens worden verwerkt, wat resulteert in een elektronendichtheidskaart, die vervolgens wordt gefit met een moleculair model. Het model kan na verfijning worden gebruikt om het werkingsmechanisme van het eiwit te onderzoeken en voor structuurgebaseerd geneesmiddelontwerp.

Het doel van dit JoVE-artikel is om te laten zien hoe we kristallen van membraanproteïnen van fractiekwaliteit produceren met behulp van lipide mesofasen via de zogenaamde in meso-methode. Een recente review van de methode en de reikwijdte ervan is beschikbaar in referentie één. Het stapsgewijze protocol dat we hier zullen volgen is beschreven in referentie twee; een stroomdiagram dat de betrokken stappen en de benodigde tijd voor het opzetten van een in meso-kristallisatie-experiment voor membraanproteïnen samenvat, wordt hier getoond.

Deze video behandelt de stappen die zijn omkaderd door rode stippellijnen. De handelingen die u moet uitvoeren voor meso-kristallisatie in de handmatige modus worden hier getoond. Deze omvatten een geconcentreerde oplossing van het gezuiverde membraaneiwitlipide voor het creëren van de gastheer-mesofase, meestal monooleïn om het lipide duidelijker zichtbaar te maken.

In deze video zijn de volgende benodigdheden gebruikt: oplossingen van rode kleurstofprecipitanten, pipetteerapparaten voor gezuiverd water en wegwerptips, een assortiment gasdichte Hamilton-spuiten (sommige met afneembare naalden), een nauwe koppeling om de eiwitoplossing met het lipide te mengen voor de productie van de mease, een herhaaldispenser van Hamilton, glazen microscoopglaasjes en dekglasjes, bij voorkeur gesiliconiseerde geperforeerde dubbelzijdige afstandhouderstape voor het maken van wells, pincetten, crushed ijs, tissues, een rekenmachine en, bovenal, uw laboratoriumnotitieboek.

De volgende procedure wordt gebruikt om een glazen sandwich-kristallisatieplaat te bereiden. Plaats voor het laden een gesilicatiseerde microscopiglasklaartje op de werkbank. Verwijder de beschermende papieren laag van één zijde van een strook geperforeerde dubbelzijdige afstandhoudende tape.

Plaats de tape met de plakzijde naar beneden op het oppervlak van het objectglas. Druk de tape stevig op het objectglas aan. Er kan aluminiumfolie tussen de tape en de roller worden geplaatst bij gebruik van een brayer of roller om de bodem van de wells te beschermen.

Verwijder de tweede papieren afdekking van de tape om het bovenste kleverige oppervlak bloot te leggen. Deze procedure resulteert in een glasplaat die klaar is voor het laden en het daaropvolgende afdekken; zodra het laden is voltooid, kunnen de individueel gesiloiseerde dekglasjes in directe nabijheid van de plaat worden geplaatst voor een snelle en efficiënte afdekking van de wells.

Plaats het lipide in een temperatuurgecontroleerd blok bij 45 °C gedurende drie minuten om het te smelten. Let op dat het gebruikte lipide doorgaans mono land is. In deze video is er een rode kleurstof aan het lipide toegevoegd voor de zichtbaarheid tijdens het smelten.

Bereid twee gasdichte Hamilton-spuiten van 100 µL voor voor gebruik. Verwijder bij de stap voor het mengen van lipide-eiwitten de Teflon-olie uit de spuit die de eiwitoplossing zal bevatten. Plaats de spuit voor het lipide daarnaast. In dit geval blijft de olie op zijn plaats.

Plaats de koppeling met kleine boring tussen de twee spuiten en verbind de koppeling vervolgens met de aansluiting van de lipidspuit. Draai de koppeling vast op de spuit, maar draai deze niet te strak aan. Verwijder de zuiger uit de cilinder van de lipidspuit.

Zorg ervoor dat het lipide gesmolten is. Stel de pipet in op 30 µL en neem langzaam 30 µL gesmolten lipide op vanuit het dopje. De lipide-vial.

De lipide dient onder stikstof of argon bij min 80 graden Celsius te worden bewaard. Breng langzaam zoveel mogelijk van de gesmolten lipide over in het open uiteinde van de spuit, waarbij zorgvuldig wordt voorkomen dat er luchtbellen ontstaan.

Plaats de zuiger in de cilinder in contact met het gesmolten lipide en beweeg de zuiger langzaam omhoog in de cilinder terwijl de spuit verticaal wordt vastgehouden. Zoals getoond, stijgt de onbedoeld ingesloten luchtbel tijdens dit proces en ontsnapt deze. We hebben nu een plug gesmolten lipide in de cilinder waarvan u het volume nauwkeurig moet bepalen.

Dit kan worden gedaan door de markeringen op de spuitcilinder af te lezen. In dit geval is het volume 23 microliters, wat wordt genoteerd in het labjournaal. Schuif de vacht over de naald die uit de koppeling steekt.

Gebruik de zuiger om het gesmolten lipide door de cilinder en langzaam en voorzichtig in de naald in de kern van de koppelaar te drukken. Als de naald enigszins te vol is, zal het lipide aan het open uiteinde naar buiten komen. Door de zuiger iets terug te trekken, kan het overtollige lipide in de koppelaar worden teruggezogen totdat het precies gelijk ligt met de punt van de naald van de koppelaar.

In dit geval is de spuitkoppelingseenheid volledig geladen en klaar om te worden gecombineerd met de eiwitspuit. De oplossing moet 10 min bij 14.000 G gecentrifugeerd worden, vijf tot 10 minuten bij vier graden Celsius, om grote aggregaten te verwijderen. Haal de eiwitoplossing uit de ijsbak en laat deze equilibreren bij kamertemperatuur voordat de kristallisatieproeven worden opgezet.

Bereken het volume proteïne-oplossing dat nodig is om de kubische fase te vormen bij of nabij volledige hydratatie voor olean bij 20 °C. Volledige hydratatie met water vindt plaats bij ongeveer 40% gewichtsprocent water, zoals aangegeven in het fasediagram. Houd er rekening mee dat we de lipidspuit hebben gevuld met 23 µL mono bij een dichtheid van 0,94 mg/µL.

Dit komt overeen met 21,6 milligram lipiden; dus 21,6 maal vier gedeeld door zes, oftewel 14,4 milligram of 14,4 microliter eiwitoplossing is nodig. Neem met een Hamilton-spuit van 25 of 50 microliter het benodigde volume eiwitoplossing op en breng de oplossing over op de Teflon-tip van de zuiger in de cilinder van de eiwitoplossing. Trek de naald voorzichtig terug, waarbij u erop let dat er geen luchtbellen ontstaan, en meet het volume eiwitoplossing in de spuit. Dit moet overeenkomen met de waarde uit de vorige stap.

Ter voorbereiding op het combineren met de met lipiden gevulde spuit. Verschuif de eiwitoplossing voorzichtig naar boven in de cilinder tot deze gelijk ligt met het open uiteinde. Dit kan worden gecontroleerd door door het uiteinde van de cilinder te kijken.

De lipide- en proteineloplossingen in de gevulde spuiten kunnen nu worden gecombineerd. Draai hiervoor de eiwitspuit in het open uiteinde van de koppeling die aan de lipidespuit is bevestigd. Nadat de twee spuiten via de koppeling zijn verbonden, moet er een continu volume vloeistof aanwezig zijn, vanaf de lipiden in de ene spuit via de koppeling tot de proteineloplossing in de andere spuit.

Ter voorbereiding op het mengen wordt de gemonteerde eenheid vastgehouden met één spuit in de rechterhand en de andere in de linkerhand. Er wordt koppel uitgeoefend op beide cilinders via de koppeling, waarbij de vingers en duimen van beide handen worden gebruikt om ervoor te zorgen dat de afdichting tegen de groeven in de koppeling intact blijft tijdens het vastdraaien. Een in dit stadium onjuist gemonteerd mengapparaat zal het ALS beschadigen en lekkage veroorzaken; overmatig vastdraaien zal eveneens tot lekkage leiden.

Het is een kwestie van ervaring, met de onvermijdelijke methode van trial-and-error en het incidentele verlies van monsters. Daarom is het zinvol om eerst te oefenen met lipiden en water of een bufferoplossing om een gevoel voor het systeem te krijgen voordat men waardevolle eiwitoplossingen gebruikt om te mengen; duw de zuiger aan de eiwitzijde van de gemonteerde mengunit met de duim of wijsvinger tot de limiet, waardoor de eiwitoplossing uit de eiwitspuit via de koppeling in de lipidenspuit wordt gedreven. Als de unit effectief is afgedicht, zal deze actie een gelijke en tegengestelde beweging van de zuiger aan de lipidenzijde veroorzaken.

De zuiger aan de lipidzijde wordt nu gebruikt om de inhoud van de lipidspuit terug door de koeler en in de eiwitspuit te drukken. Dit proces wordt herhaaldelijk uitgevoerd. Soms zijn honderd passages of meer nodig om een homogene misa-fase te verkrijgen.

Aan het begin van het mengen kan de beweging van het materiaal heen en weer door de koppeling ongelijkmatig zijn, waardoor er soms extra kracht nodig is om het mengen te bewerkstelligen. Dit is te verwachten. De initiële menging gaat meestal gepaard met de vorming van een niet-uniforme troebeling in het monster, wat eveneens wordt verwacht.

Naarmate de homogenisatie vordert, wordt de textuur, zoals waargenomen door de kracht die nodig is om de zuigers heen en weer te bewegen, uniformer en kenmerkend voor de viskeuze kubische fase, evenals het visuele aspect van de ontstane kubische fase. Indien de omstandigheden passend zijn en de kubische fase zich vormt, moet de dispersie er optisch transparant uitzien in de spuitcilinder.

De markeringen op de spuitcilinder moeten dus duidelijk leesbaar zijn door de mesofase in de cilinder. In het geval van gekleurde eiwitten heeft de mesofase de kleur van het eiwit, maar blijft deze optisch transparant. Het zeer licht koelen van het monster tijdens het mengen door de spuitmenger korte tijd op ijs te plaatsen, kan de homogenisatie en het bereiken van transparantie versnellen.

Het is echter belangrijk om het monster niet overmatig te mengen; er moet voorzichtigheid worden betracht om extreem krachtig mengen te vermijden, aangezien dit kan leiden tot een stijging van de monstertemperatuur door wrijvingswarmte. Op dit punt is de cubische mesofase gevormd en is het eiwit gereconstitueerd in de lipide dubbellaag. De mesofase is nu klaar om in de individuele putjes van de kristallisatieplaten te worden gedoseerd.

Eerst moet de meso-fase echter worden overgebracht naar een Hamilton-spuit van 10 µL die is gemonteerd op een repeterende dispenser. Begin dit proces door de spuit aan de dispenser te koppelen. Vul de spuit met de kubische meso-fase.

Verwijder de naald en de zuiger uit de spuit. Laat de Teflon-ring op zijn plaats. Verwijder de borgmoer van de dispenser met behulp van een kleine munt.

Zorg dat de palarm volledig is ingetrokken. Plaats de spuit zonder zuiger en naald door de houdring van de dispenser. Plaats de borgmoer met de pakking naar de spuit toe en draai deze stevig vast op het open uiteinde van de spuit.

Er moet zorgvuldig worden gecontroleerd of de spuit correct in het midden van de houdering is geplaatst en of de cilinder parallel aan de palletarm is uitgelijnd. Beide kunnen door I worden beoordeeld. Deze twee vereisten zijn belangrijk, omdat er anders druk kan ontstaan in de bronspuit tijdens het laden als de zuiger niet vrij beweegt, wat kan leiden tot lekkage. Voer de zuiger met de grijpmoer, enkele slagen loss gedraaid, door de grijpring en geleid de zuiger in het open uiteinde van de spuit.

Druk de ratelarm volledig in om de zuiger in de cilinder te bewegen en controleer of deze ongehinderd en volledig door de cilinder kan bewegen. Indien de schroef en de geleidestang waren losgedraaid, draai deze dan opnieuw vast en controleer opnieuw of de zuiger vrij kan bewegen. De doseerspuit is nu klaar om te worden geladen.

Beweeg de zuiger aan één zijde van de gemonteerde mengunit naar de nul microliter-graduatiemarkering. Om de mesofase over te brengen naar de andere spuit en de koppelaar. Koppel de lege spuit, met de UL op zijn plaats, los van de mengunit en verbind onmiddellijk de geladen spuit, met de bevestigde koppelaar, met de schroefdraadaansluiting van de 10 microliter doseerspuit.

De mate van stevigheid waarmee de koppeling wordt uitgevoerd is van kritiek belang. Zoals reeds vermeld, wordt de doseerspuit gevuld door de zuiger van de 100 microliter spuit in te drukken, zodat de meso-fase via de koppelaar wordt overgedragen. Als de koppeling stevig is en de zuiger in de doseerspuit vrij kan bewegen, dan moet de zuiger in de richting van de beweging van de vulzuiger beginnen te bewegen naarmate de doseerspuit zich vult.

Koppel de laadspuit met de bevestigde koppeling los van de doseerspuit. Bevestig een korte naald met een platte punt aan de stalen aansluiting van de doseerspuit en draai deze voorzichtig vast. Klem de zuiger aan de ratelarm door de knoop in de grijpring aan te trekken.

Er moet erop worden gelet dat de knoop niet te strak wordt aangetrokken, omdat dit de zuiger kan beschadigen en vervormen, waardoor deze onbruikbaar wordt. Het is belangrijk dat de bewegingsruimte van de ratelarm in geklemde toestand beperkt blijft tot maximaal een inch.

Zoals hierna wordt getoond, zal de zuiger de neiging hebben om door te buigen en kan de afgifte mislukken. Druk meerdere keren op de ratelcilinder om de zuiger in de cilinder naar voren te bewegen, waardoor het lege volume van de naald wordt gevuld en de naald wordt geladen. Deze stap moet tot 10 keer worden herhaald totdat er een continue draad van de mesa-fase uit de punt van de naald komt.

De naald is nu klaar voor gebruik bij het opzetten van crystallisatieproeven, welke onmiddellijk moeten worden gestart. Het is niet aanbevolen om de met proteïne geladen kubische fase te lang te bewaren voordat de crystallisatieproeven worden opgezet. Omdat sommige proteïnen onstabiel zijn in de kubische fase zonder toegevoegd precipitant, plaatst u een multi-well crystallisatieplaat en een dekglas op een oppervlak dat enkele inches boven de workbench is verhoogd om het laden te vergemakkelijken.

Optimaal contrast en verbeterde zichtbaarheid worden bereikt wanneer het oppervlak licht donker is. Homogeniseer de precipitante-oplossingen en verwijder de doppen van de vials. Stel de dispenser voor de precipitant in op één µL; houd de doseerspuit met één hand verticaal en gebruik de vrije hand om de naaldpunt in het midden en direct boven de bodem van de well te positioneren.

Stap één. Druk op de knop van de herhalende dispenser om een bolus van de vloeistof op het glasoppervlak te brengen. Het volume van de bolus is 200 nanoliters.

Wanneer de standaard herhalende dispenser wordt gebruikt met een spuit van 10 µL, moet de punt van de naald niet meer dan enkele honderden µm boven de bodem van het putje zich bevinden. Om een correcte aflevering te waarborgen, is een reproduceerbare aflevering eenvoudig te bereiken; dit vereist enkel wat oefening. Nadat de vier aangrenzende putjes met mease zijn gevuld, wordt er 1 µL precipitantoplossing bovenop elke mease-bolus geplaatst.

Plaats met behulp van een pipet van twee microliter en standaard wegwerptips zo snel mogelijk een dekglas recht over de gevulde putjes, zodat deze gelijkmatig worden afgedekt om een waterdichte afsluiting te bewerkstelligen. Gebruik een spatel om druk uit te oefenen op het dekglas op de plaatsen waar het in contact komt met het blootgestelde kleverige oppervlak van de afstandhouder-tape. Het proces van het toevoegen en dispenseren van het precipitaat kan worden herhaald totdat alle putjes op de plaat zijn gevuld en afgesloten.

De plaat is nu klaar voor inspectie en incubatie. Label de plaat duidelijk voor trackingdoeleinden. Lichtgevoelige eiwitten worden gewoonlijk behandeld door de platen in aluminiumfolie te wikkelen voordat ze in de incubatiekamer worden geplaatst.

Deze kunnen worden verwijderd en onder de microscoop worden onderzocht bij gedimd of passend gekleurd licht. Plaats de platen op regelmatige basis in een temperatuurgecontroleerde kamer, gewoonlijk bij ongeveer 20 °C. Inspecteer de wanden op kristalgroei met behulp van een polarisatiemicroscoop met een 10x of 20x objectief.

Doelstelling: het schema dat in het laboratorium van de auteur wordt gebruikt is als volgt: dag 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 na het zetten. Inspecteer de mease-bolus zorgvuldig. Pas de scherptediepte aan binnen het monster van 140 micron dik.

De inspectie dient zowel onder normaal licht als tussen gekruiste polarisatoren te worden uitgevoerd; kleurloze membraaneiwitkristallen die groeien in de kubische fase zien er onder normaal licht zo uit. Kleurloze membraaneiwitkristallen die groeien in meso zien er onder gepolariseerd licht zo of zo uit, en natuurlijk gekleurde membraaneiwitten die groeien in meso zien er onder normaal licht zo of zo uit.

De volgende stappen in het algemene proces van structuurbepaling zijn het oogsten en cryogeen koelen van de kristallen, en het opnemen en verwerken van de röntgendiffractie daarvan. Deze onderwerpen worden behandeld in afzonderlijke JoVE-artikelen in deze serie.