Het beoordelen van twee-dimensionale Kristallisatie Trials van kleine membraaneiwitten voor Structurele Biologie Studies van Electron Kristallografie

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van de meest optimale 2D-kristallisatiecondities voor de structurele bepaling van membraaneiwitten via elektronkristallografie. Dit wordt bereikt door tijdens de zuivering eerst een compatibel detergens te gebruiken om het eiwit uit de natuurlijke lipide dubbellaag te solubiliseren. De tweede stap van de procedure is het toevoegen van exogeen lipide en het verwijderen van detergent via dialyse van het mengsel van eiwit, lipide en detergens, wat resulteert in 2D-kristallen onder zorgvuldig gecontroleerde condities.

De derde stap van de procedure is het flash-freezen van de monsters tot een vitreuze toestand. De laatste stap van de procedure is het verzamelen van gegevens via cryo-EM. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die, via computationele beeldbewerking van de gegevens, leiden tot de uiteindelijke structuur van het eiwit.

Hallo, ik kom uit het laboratorium van de School of Biology aan het Georgia Institute of Technology. Hallo, ik ben Tina Dreaded.

Ik ben van het Berry Lab van de school voor Chemie en Biochemie en het Schmidt Kray Lab van de school voor Biologie aan het Georgia Institute of Technology. En ik ben Matt Johnson van het laboratorium van Ingleborg Schmidt Cry van de school voor Biologie aan het Georgia Institute of Technology. Vandaag laten we u een procedure zien voor het beoordelen van 2D-colocalisatie-experimenten met behulp van EM.

Wij gebruiken dit protocol in ons laboratorium om 2D-kristallisatiecondities te identificeren en te optimaliseren. Laten we beginnen. Om deze procedure te starten, worden negatief gekleurde monsters voorbereid op koolstofgecoate TEM-roosters (transmissie-elektronenmicroscopie) van koper met een 400 mesh. Pipetteer 2 µL van het proteoliposoommonster onder een koolstofbedekt TEM-rooster en incubeer dit gedurende 60 seconden.

Als het monster zich niet gelijkmatig verspreidt, veeg het dan voorzichtig uit met de zijkant van de pipetpunt. Blok vervolgens de rand met een gescheurd stukje Watman nummer 4 filterpapier. Dit waarborgt een optimale verwijdering van de vloeistof zonder overmatige verwijdering van protea-liposomen en helpt de delicate koolstoffilm te behouden.

Direct na het blotten. Breng na 30 seconden twee microliters van de 1%uranylacetaatkleuring aan en blot vanaf de rand van het rooster. Indien het monster hoge concentraties viskeuze glycerol of sucrose bevat, gewoonlijk in het bereik van 10 tot 20%, kunnen meerdere wascycli van het rooster met een glycerol- of sucrosevrije buffer vóór de negatieve kleuring helpen om een correcte kleuring met de uranylacetaatoplossing mogelijk te maken.

Zodra de rasters zijn voorbereid, wordt elektronenmicroscopie gebruikt om het monster bij een lage vergroting te visualiseren om de distributie en morfologie van de membranen en de algehele kwaliteit van het raster te beoordelen. Vervolgens wordt een hoge vergroting gebruikt om beelden te verkrijgen en RIA-transformaties van de beelden uit te voeren om 2D-kristallen te identificeren. Om te beginnen, plaats het raster in de monsterhouder van de elektronenmicroscoop en gebruik een tussenliggende vergroting van 2000 tot 10 000 x om een eerste indruk te krijgen van de gemiddelde membraandistributie.

Noteer de mate van distributie van de membranen, hun morfologie en grootte in een laboratoriumnotitieboek. Leg representatieve beelden vast met een CCD-camera. Observeer vervolgens, indien nodig, de monsters bij een lage vergroting in het bereik van ongeveer 400 tot 800 x om een overzicht van de grids te krijgen.

Dit kan waardevolle informatie bieden om de rasterpreparatie te evalueren door problemen met de monsterconcentratie, een ongelijkmatige distributie van protea-liposomen en gedeeltelijke breuken in de koolstoffilm aan het licht te brengen. Identificeer een rastergebied van belang bij een lage of gemiddelde vergroting. Gebruik vervolgens een hoge vergroting om de mogelijke ordening in verschillende membranen te evalueren.

Dit is van cruciaal belang in de vroege stadia van 2D-kristallisatieproeven. Om veelbelovende proteoliposomen met goed geordende gebieden te identificeren en de reproduceerbaarheid tijdens latere experimenten te verifiëren, dient men bij het bepalen van de optimale instelling voor hoge vergroting voor het screenen van 2D-kristallen te beginnen met een vergroting tussen 50.000 en 60.000 x. Afhankelijk van de afmetingen van het 2D-kristal en de grootte van de eenheidscel kan de instelling voor hoge vergroting worden verlaagd tot 30.000 of verhoogd tot 80.000.

Hier, op een aangrenzende locatie aan het beeldgebied van interesse, defocussen we met ongeveer min 400 nanometer of meer als er onzekerheid is over de vraag of het gebied van interesse inderdaad een membraan is. Inspecteer het monster op stukjes koolstoffilm, MICA of andere artefacten die voor proteoliposomen zouden kunnen worden aangezien. Observeer daarnaast de randen om typische membraanvouwing en morfologie te onderscheiden.

Inspecteer vervolgens het gebied van belang met een CCD-camera. Wanneer er een CCD-afbeelding wordt verzameld bij de optimale hoge vergroting, is het rooster van een kleiner en/of hoofdzakelijk hydrofoob membraaneiwit mogelijk niet waarneembaar door visuele beoordeling van de CCD-afbeelding zelf. In dat geval wordt de gehele afbeelding gebruikt voor een online Fourier-transformatie of FT.

Wanneer het geordende array echter klein is, zal deze FT een aanzienlijke hoeveelheid ruis bevatten. Om de signaal-ruisverhouding te verbeteren, moet de grootte van het geselecteerde kader worden verkleind, dit verkleinde kader over de afbeelding worden verschoven en een live FT worden uitgevoerd; pas vervolgens de gammafunctie van de live FT aan voor een optimale identificatie van geordende arrays. Een te hoge gammawaarde kan vlekken maskeren door ruisbijdragen, terwijl een overmatig lage waarde ertoe zal leiden dat zwakkere vlekken niet worden geïdentificeerd. Ga ervan uit dat de resolutie van de negatief gekleurde 2D-kristallen ongeveer 15 angstroms bedraagt bij een DFO van minus 400 nanometers.

Verwacht één tot drie ordes van spots te identificeren. Let op de scherpte van de spots en eventuele mosaiciteit. 2D-kristallen van een klein membraaneiwit van 18 kilodalton hebben een grootte tot enkele microns.

Scherpe vlekken op de FT die gemakkelijk te identificeren zijn bij beweging van de live FT-box tonen aan dat het rooster continu is en geen mozaïek vertoont. Het rooster van een groter eiwit met een uitgebreider oplosbaar domein kan worden geïdentificeerd op het kleine scherm van de T-E-M-C-C-D beeldcollectie; FT zijn nodig om een betere beoordeling van de roosterkwaliteit te krijgen, inclusief kenmerken zoals mozaïekruis in de FT van een ongeordend protea. Liposomen kunnen worden aangezien voor zwakke vlekken; het moet worden bepaald of de vlekken worden veroorzaakt door kleine 2D-eiwitkristallen of door ruis.

Verplaats het doosje voor de live ft. Als de vlekken onmiddellijk verdwijnen, is er sprake van ruis, maar als ze onveranderd blijven over zelfs een klein gebied, zijn er waarschijnlijk kristallen aanwezig, aangezien lipidekristallen een kenmerkende morfologie en ft vertonen. Deze lipidekristallen kunnen ook worden herkend door visuele inspectie van een afbeelding en consistente eenheidscelformaten.

Bij initiële proeven kan precipitatie optreden. Inspectie bij hoge vergroting wordt gebruikt om onderscheid te maken tussen eiwitprecipitatie en lipidaggregaten. In het geval van lipidaggregaten kan reconstitutie mogelijk al hebben plaatsgevonden, waardoor voor volgende experimenten alleen aanpassing van parameters nodig is om de membraangrootte te vergroten en orde te creëren, in plaats van om reconstitutie te induceren bij 30, 000 tot 50, 000 x.

De randen van deze donkere structuren onthullen dat ze zijn opgebouwd uit membranen zonder proteïnen. Neerslagmonsters onder optimale omstandigheden zullen een groot percentage 2D-kristallen bevatten. Het is niet nodig om te streven naar een homogeen uiterlijk van de membranen, aangezien de grootste en meest goed geordende 2D-kristallen visueel worden geselecteerd voor gegevensverzameling.

Deze soorten monsters zijn gemakkelijk te herkennen wanneer de kristallisatie van dergelijke monsters wordt gebruikt voor cryo-EM data-acquisitie om het maximale aantal beelden met een hoge resolutie te verkrijgen. We zullen u laten zien hoe u bij deze procedure kunt screenen op 2D-kristallen van kleine membraaneiwitten met TEM. Het is belangrijk om grondig te zijn, zodat u geen veelbelovende kristallisatieconditie over het hoofd ziet, aangezien u tot dit punt al een aanzienlijke hoeveelheid tijd en moeite heeft geïnvesteerd.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.