High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten Met behulp van de lipidische Bicelle Method
9 januari 2012
Bicelles zijn lipide / amfifiele mengsels die membraaneiwitten (MP's) te behouden binnen een lipide bilaag, maar hebben een unieke fase gedrag dat high-throughput screening vergemakkelijkt door kristallisatie robots. Deze techniek heeft met succes geproduceerd een aantal hoge resolutie structuren van zowel prokaryotische en eukaryotische bronnen. Deze video beschrijft protocollen voor het genereren van de lipidische bicelle mengsel, waarin parlementsleden in de bicelle mengsel, het opzetten van kristallisaties trials
Deze video demonstreert een methode voor het opzetten van high-throughput kristallisatieproeven van gezuiverde membraaneiwitten met behulp van Lipic B-cellen. Eerst worden B-cellen geprepareerd door een lipide en een detergent te mengen, waarna het gezuiverde membraaneiwit in het B-celmengsel wordt geïncorporeerd en de kristallisatieproeven worden uitgevoerd met een nanoliter-robot. Visuele inspectie met een standaard lichtmicroscoop onthult de aanwezigheid van kristallen.
Zodra ze zijn gevormd, kunnen de proteïnekristallen worden geëxtraheerd en ingevroren voor datacollectie en structuurbepaling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat, dankzij het unieke fasegedrag van B-cellen, standaardapparatuur en robotica die in het laboratorium beschikbaar zijn, kunnen worden gebruikt voor kristallisatie. Het opzetten van B-cellen is een zeer eenvoudige techniek en stelt u in staat om uw doelwitmembraaneiwit uit de detergentmicel te halen en in een lipide medium te plaatsen.
Dit biedt u een geheel nieuwe set condities om te screenen. Het is een methode die zo eenvoudig is en met succes is toegepast op veel membraaneiwitten, dat er simpelweg geen reden is om het niet te proberen. De eerste stap bij kristallisatie op basis van B-cellen is de bereiding van een lipiden-amfiphiel mengsel voor de vorming van B-cellen.
Dit proces vereist aanzienlijke inspanning en is het meest tijdrovend. Houd er rekening mee dat het meerdere uren kan duren om te voltooien. B-cellen kunnen worden gevormd in diverse combinaties van lipiden en amfifielen en over een breed scala aan concentraties.
Raadpleeg tabel één in het bijbehorende geschreven protocol voor voorgestelde startpunten; begin met het bereiden van één milliliter van een 35% DMPC-Chapo-mengsel bij een molaire ratio van 2,8 op één. Weeg hiervoor 0,26 gram DMPC en 0,09 gram Chapo af in een buisje. Vul het volume aan tot 1,0 milliliter met gedeïoniseerd water en vortex het mengsel.
Warm het mengsel vervolgens in een waterbad op tot ongeveer 40 °C totdat het daarna gelei-achtig wordt. Plaats de buis op ijs. Het monster zou weer vloeibaar moeten worden.
Vortex vervolgens opnieuw gedurende enkele minuten en herhaal de cycli van opwarmen, afkoelen en vortexen totdat het lipide volledig is opgelost. Houd er rekening mee dat het mengsel naarmate er meer cycli worden uitgevoerd, bij afkoeling aan het einde troebel kan worden. Het mengsel zal een heldere gel zijn bij of boven kamertemperatuur, en een viskeuze vloeistof op ijs; cellen kunnen voor langdurige bewaring bij -20 °C worden bewaard.
Vervolgens worden de gezuiverde eiwitten toegevoegd aan het B-celmedium. Dit is een eenvoudig proces dat op dezelfde dag als de kristallisatie moet worden uitgevoerd, wat in het volgende gedeelte van de video wordt getoond. Ontdooi het DMPC capso B-celmengsel bij kamertemperatuur totdat de fase verandert in een heldere gel.
Plaats het mengsel op ijs om het te laten smelten en vortex het vervolgens kort om een homogene B-celphase te herstellen. Houd vanaf dit punt het B-celmengsel en het gezuiverde eiwit op ijs. Dit houdt de B-cel in een vloeibare fase, waardoor deze geschikt is voor pipetteren.
Voeg vervolgens het B-celmengsel toe aan het gezuiverde, in detergent gesolubiliseerde eiwit in een volumeverhouding van één op vier. Pipetteer daarna voorzichtig op en neer totdat de oplossing helder en homogeen wordt. Als er bellen ontstaan, kunnen deze kortstondig worden gecentrifugeerd in een tafelcentrifuge.
Incubeer het mengsel minstens 30 minuten op ijs om de volledige incorporatie van het eiwit in de cellen te bevorderen. Het mengsel van eiwit en cellen is nu klaar voor kristallisatieproeven. De kristallisatieproeven worden gedemonstreerd met gebruik van een mosquito kristallisatierobot.
Koel een 96-well V-bodemplaat af door deze op ijs te plaatsen. Pipetteer het eiwit-celmengsel in de plaat om ervoor te zorgen dat de viscositeit van de oplossing minimaal is. Houd het eiwit-celmengsel op ijs tot de laatste stap.
De hier gebruikte robot heeft vijf platforms. Plaats de microplaat met het reservoir op platform drie en het crystallisatiedeksel waarop de druppels worden gedoseerd op platform vijf. Plaats vervolgens de proteïne-per-celplaat op platform vier, het dichtst bij de doseerpositie.
Dit waarborgt dat het eiwit-celmengsel als laatste door de robot wordt opgenomen en onmiddellijk wordt afgegeven. Start de run via de software; de robot neemt eerst de reservoirvloeistof op, gevolgd door het eiwit-celmengsel, en brengt deze als druppels aan op het deksel om opwarming en een toename van de viscositeit tijdens het dispenseren te voorkomen. Programmeer de mosquito niet om het reservoir met het eiwit-celmengsel te mengen zodra de run is voltooid.
Verwijder de plaat met buy cell-eiwit uit het instrument en plaats deze op ijs. Verwijder het deksel van het instrument en plaats dit op de plaat met de reservoir-oplossing, zodanig dat de druppels zijn omgekeerd. Incubeer de plaat bij 20 °C.
Houd er rekening mee dat er ook andere temperaturen getest kunnen worden voor kristalvorming en optimalisatie. Hogere temperaturen induceren de lamellaire fase, wat het voordeel heeft dat het eiwit vooraf in lagen wordt georganiseerd. Temperaturen tussen 4 °C en 20 °C kunnen worden gescreend.
Temperaturen onder vier graden Celsius kunnen ervoor zorgen dat de lipiden over langere perioden neerslaan; beoordeel op de eerste, derde dag en daarna wekelijks het uiterlijk en de groei van de kristallen met een standaard lichtmicroscoop. Hier worden een brightfield-afbeelding en een UV-afbeelding getoond van naaldvormige kristallen waargenomen in de conditie 'alleen aanval'. Er werd geen fluorescentie gedetecteerd vanuit de kristallen, wat duidt op een fout-positief resultaat in deze afbeelding.
Een staafvormig kristal dat ontstond toen methylpropaandiol als precipitant werd gebruikt. Het kristal vertoonde zwakke fluorescentie, wat erop wees dat het een proteïnekristal zou kunnen zijn, maar bleek na röntgendiffractie niet-proteïneachtig te zijn. Hier wordt een kristal getoond dat ongeveer vier weken na het opzetten van de trials werd waargenomen.
De sterke fluorescentie onder UV-licht bevestigt dat het om een proteïnekristal gaat. Zoals u in deze video heeft gezien. Zodra B-cellen beschikbaar zijn, kunnen deze direct worden gemengd met gezuiverd proteïne en vanaf dit punt verloopt de kristallisatie vrijwel exact volgens standaard detergent-gebaseerde protocollen.
Een ander duidelijk voordeel is de mogelijkheid om B-cellen te doteren met specifieke lipiden voor optimalisatiedoeleinden. De techniek is zeer veelzijdig en zo eenvoudig in gebruik dat deze voor alle projecten betreffende de kristallisatie van membraaneiwitten zou moeten worden geprobeerd.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze video demonstreert een methode voor het opzetten van high-throughput kristallisatieproeven van gezuiverde membraaneiwitten met behulp van lipidische bicellen. De techniek maakt het mogelijk om membraaneiwitten in een lipid medium te incorporeren, wat het kristallisatieproces faciliteert.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Structurele biologie
- Membraaneiwitkristallisatie
- Biofysica
Achtergrond
- Bicellen zijn mengsels van lipiden/amfifielen die membraaneiwitten stabiliseren binnen een lipide dubbellaag.
- Deze techniek heeft een uniek fasegedrag dat gunstig is voor high-throughput screening.
- Het is succesvol gebruikt voor het produceren van hoge-resolutiestructuren uit diverse bronnen.
- Standaard laboratoriumapparatuur kan worden gebruikt voor kristallisatie-experimenten.
Doel van de studie
- Om de bereiding van bicellen voor de kristallisatie van membraaneiwitten te demonstreren.
- Om te laten zien hoe membraaneiwitten in het bicellenmengsel kunnen worden geïncorporeerd.
- Om het proces van het opzetten van kristallisatie-experimenten te schetsen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van bicellen door het mengen van lipiden en detergent.
- Inbouw van gezuiverde membraaneiwitten in het bicelmengsel.
- Kristallisatieproeven uitgevoerd met behulp van een nanoliterrobot.
- Visuele inspectie van kristallen met een standaard lichtmicroscoop.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vorming van proteïnekristallen uit het bicellesmengsel.
- Kristallen kunnen worden geëxtraheerd en ingevroren voor datacollectie.
- De techniek maakt een efficiënt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur mogelijk.
- High-throughput-mogelijkheden verbeteren het kristallisatieproces.
Conclusies
- Bicelles bieden een levensvatbaar medium voor de kristallisatie van membraaneiwitten.
- De methode vereenvoudigt de overgang van eiwitten van detergenten naar lipidische omgevingen.
- Deze aanpak kan leiden tot een verbeterde structurele bepaling van membraaneiwitten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Membraaneiwitkristallisatie blijft een knelpunt bij structuurgebaseerde geneesmiddelenontwikkeling vanwege de hydrofobiciteit van eiwitten en hun instabiliteit in detergentmicellen. De lipidische bicellemethode biedt een meer natuurgetrouwe lipideomgeving die de eiwitstabiliteit en kristalkwaliteit verbetert, waardoor betrouwbare structurele gegevens voor doelwitvalidatie mogelijk worden. Deze benadering ondersteunt mechanisch risicobeheer in een vroeg stadium door hoogresolutie-inzichten in drug-bindingspockets en conformationele toestanden te faciliteren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt structurele bepaling van membraanproteïnen in een lipidisch milieu mogelijk dat de native conformatie en ligandbindingsplaatsen beter behoudt.
- Operationele waarde: Vermindert de afhankelijkheid van uitgebreide detergent-screening door een gestandaardiseerde lipidische matrix te bieden voor crystallisatieproeven.
- Predictieve waarde: Hoogwaardige kristallen ondersteunen nauwkeurige modellering van proteïne-ligandinteracties, waardoor het vertrouwen in hypothesen over target engagement toeneemt.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert kristallen van diffractiekwaliteit die atomaire resolutie mogelijk maken voor structuurgestuurd geneesmiddelendesign.
- Operationele waarde: Compatibel met standaard nanoliter liquid-handling robotica, waardoor integratie in bestaande high-throughput crystallizatie-pipelines mogelijk is.
- Schaalbaarheid: De lage viscositeit van bicelle-eiwitmengsels vergemakkelijkt het automatische dispenseren en vermindert technische barrières voor automatisering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Structuren verkregen via bicelle-kristallisatie informeren het ontwerp van selectieve remmers met verbeterde farmacokinetische profielen.
- Mechanische Risicoreductie: Maakt visualisatie mogelijk van conformationele toestanden die relevant zijn voor allostere modulatie en gating-mechanismen.
- Relevantie voor Preklinische Modellen: Ondersteunt structuurgebaseerde optimalisatie van leads gericht op ziekte-geassocieerde membraanproteïnen uit diverse organismen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De bicelle-methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadoptimalisatie en levert structurele gegevens die een basis vormen voor medicinale chemie en de selectie van preklinische kandidaten.
- Discovery Biology: Ondersteunt het testen van hypothesen door visualisatie van de architectuur van membraaneiwitten en ligandbindingsplaatsen in een bijna-natieve lipide-omgeving mogelijk te maken.
- Screening: Genereert kristallisatiecondities die compatibel zijn met robotische screening, waardoor de doorvoer en de dekking van condities worden vergroot.
- Analytics: Levert röntgendiffractiegegevens die elektronendichtheidskaarten bieden voor nauwkeurige modelbouw en validatie van de ligandpositie.
- Translationeel onderzoek: Verbindt atomaire structuren met functionele assays, waardoor correlatie van bindingsaffiniteit met structurele verstoringen mogelijk wordt.
- Enterprise hergebruik: Bicelle-formuleringen kunnen worden gestandaardiseerd en opgeslagen voor herhaald gebruik bij meerdere membraaneiwitdoelen, waardoor de variabiliteit van reagentia wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert het succespercentage van membraaneiwitkristallisatie door de lipidendubbellaagomgeving na te bootsen.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur en robotica, waardoor gespecialiseerde hulpmiddelen voor het hanteren van hoge viscositeit niet meer nodig zijn.
- Strategische waarde: Versnelt de identificatie van lead-verbindingen door de tijd tot structuurbepaling voor uitdagende membraaneiwittargets te verkorten.
- Impact op portfolio: Maakt datagedreven go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van betrouwbare structurele inzichten in de druggability van targets.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de omgang met lipiden en membraaneiwitbiochemie om lipide:detergent-ratio's en eiwitincorporatie te optimaliseren.
- Is afhankelijk van toegang tot crystallisatierobotica en incubatiesystemen met temperatuurbeheersing voor de opzet en monitoring van trials.
- Necessiteert standaardisatie van protocollen voor de bereiding van bicellen tussen teams om de reproduceerbaarheid van crystallisatieresultaten te waarborgen.
- Omvat optimalisatie van de lipidesamenstelling (bijv. DMPC:CHAPSO-ratio's) en screening van precipitantia om te voldoen aan eiwitspecifieke crystallisatiebehoeften.
- Wordt beperkt door de noodzaak van koude handling tijdens de bereiding om de vloeibaarheid van de bicellen te behouden en vroegtijdige faseovergangen te voorkomen.
