Gene Trapping behulp Gal4 in zebravis
29 september 2013
Dit protocol beschrijft de methode van de genetische val insertiemutagenese behulp Gal4-VP16 als primaire verslaggever en GFP / RFP als secundaire verslaggevers in zebravis. Ongeveer een op de tien high-uitdrukken F0 vis opbrengst gene trap nageslacht co-GFP en RFP. De screeningsprocedure kan gemakkelijk worden opgeschaald te passen aan de grootte van het laboratorium dat de insertie mutagenese scherm.
Het algemene doel van deze procedure is om mutante vissen te produceren met behulp van genbrekende transpositie op vectoren met GAL vier, VP 16 als de primaire genvangstreporter. Dit wordt bereikt door eerst het genvangstvector samen met de twee transposities in zebravisembryo's te co-injecteren. Geïnjecteerde embryo's worden gescreend op GFP-fluorescentie op drie dagen na bevruchting en ongeveer 30% van de helderste embryo's worden geselecteerd om het F nul-zwembad te vestigen.
Vervolgens worden de F nul-vissen gekruist met de U-A-S-M-R-F-P-testerlijn om te screenen op overdracht van genvangstgebeurtenissen in de kiemcellen. De laatste stap is om de F1 te kruisen om de F twee-generatie te vestigen en embryo's te genereren voor moleculaire karakterisering van genvangstgebeurtenissen door inverse PCR en vijf prime race. Uiteindelijk zou ongeveer één op de tien gescreende F nul-vissen genvangstnakomelingen moeten produceren.
Genbrekende transpositie werd ontworpen om geen mutaties te produceren bij integratie in entrees van eiwitcoderende genen. Onze GBT-vectoren gebruiken G vier P 16 als de primaire genvangstreporter. Deze wijziging verhoogt de gevoeligheid voor genen die op laag niveau worden tot expressie gebracht en maakt het mogelijk om genvangstmutanten te gebruiken zonder over vermeden fenotypes als G vier-drivers voor weefselspecifieke expressie van andere transgenen.
Wij geloven dat de belangrijkste bottleneck van onze methode ligt in het bereiken van voldoende hoge percentages van genvangstintegratie in de kiemcellen van F nul-vissen. In deze demonstratie zullen we verschillende cruciale stappen behandelen, DNA-voorbereiding, MICROINJECTIE en F nul-screening. De GBTB een genvangstvector gebruikt GAL vier VP 16 als de primaire genvangstreporter.
Minimale lange twee transposities op de uiteinden worden gebruikt voor genvangstintegratie. Genvangstgebeurtenissen worden direct gedetecteerd door een EGFP-reporter onder de controle van 14 X GAL vier UAS. De volledige genvangstcassette wordt geflankeerd door directe locks P-sites.
Dit maakt genvangstgebeurtenissen omkeerbaar door expressie van Cree combs om een bewijs van een causaliteitsrelatie tussen een specifieke genvangstintegratie en een waargenomen fenotype te vestigen. Bovendien wordt de U-A-S-E-G-F-P cassette geflankeerd door directe FRT-sites. Injectie van flip combs-mRNA zal leiden tot excisie van de U-A-S-E-G-F-P cassette, waardoor de genvangstmutatie ongemarkeerd blijft door EGFP-fluorescentie en de mogelijkheid biedt om deze te gebruiken in transgene lijnen die specifieke weefsels of ontwikkelingsgebeurtenissen markeren door GFP-fluorescentie vóór micro-injectie.
Bereid de transpositie op DNA en transposities mRNA voor. Bereid het GBTB een genvangstvector DNA voor. Bij gebruik van een standaard mini prep kit en volgens het protocol van de fabrikant, is het essentieel om de PB-wasstap op te nemen bij het voorbereiden van het DNA.
Anders zal het mini prep DNA worden besmet door RNA's, wat leidt tot afbraak van de transposities Mr.NA, verdun het DNA in RNA-vrij water tot 10 nanogram per microliter. Om de lange twee transposities mRNA voor te bereiden, lineairiseer eerst PT drie TS T twee met xbo een. Vervolgens transcribeer het lineaire DNA met behulp van een M-berichtmachine T drie in vitro transcriptiekit met één wijziging.
Voeg 0,5 microliter rib lock RNA's-remmer toe na de behandelingsstap van het DNA, zuiver mRNA met behulp van een standaardkit en beoordeel de kwaliteit van het in vitro getranscribeerd mRNA door middel van agros-gelelektroforese. Verdun het mRNA in RNA-vrij water tot 40 nanogram per microliter en bewaar als twee microliter-aliquots bij negatief 80 graden Celsius vlak voor de micro-injectie. Bereid het injectiemengsel voor door acht microliter verdund transpositie op DNA toe te voegen aan een twee microliter-aliquot van transposities mRNA.
Injecteer drie nanoliter van het D-N-A-R-N-A-mengsel in de dooier van één cel zebravisembryo's met behulp van standaard micro-injectietechnieken, gericht op de dooier-blasfemeer-interface. Na de injectie, laat vijf microliter resterende injectieoplossing draaien op een 1%-aros-gel voor kwaliteitscontrole om ervoor te zorgen dat het transposities mRNA niet is afgebroken ongeveer zes tot acht uur na de injectie. Verwijder onbevruchte en dode embryo's en verdeel de embryo's over 60 tot 80 per 100 millimeter Petri-schaal. Abnormale en dode embryo's worden verwijderd op een dag na bevruchting, twee dagen na bevruchting en drie dagen na bevruchting. Op drie dagen na bevruchting onder een stereo-microscoop uitgerust met fluorescentie of een rechtopstaande microscoop.
Screen de embryo's en verwijder eventuele abnormale embryo's. Screen de overgebleven embryo's zonder overduidelijke defecten. Voor GFP-fluorescentie, selecteer de helderste F nul-embryo's en kweek ze op met behulp van standaard zebravis-kweekprocedures in dit laboratorium.
GBT's worden meestal geïnjecteerd in lijnen met wildtype of luipaardpigmentatiepatronen. Het is redelijk om te verwachten dat 20 tot 30% van de geïnjecteerde embryo's die voor kweek zijn geselecteerd, zullen overleven tot volwassenheid. Integratie van de GBTB een genvangstvector kan leiden tot EGFP-expressie door middel van twee verschillende mechanismen.
De eerste is een echte genvangstgebeurtenis. De vector integreert in een gen een fusietranscript tussen het vijf-prime van dat endogene gentranscript en de GAL vier VP 16 wordt gemaakt en vertaald in een fusie-eiwit dat het eindterminus van het eiwit bevat en bedekt door het ingebouwde gemuteerde gen en GAL vier, VP 16. Dit fusie-eiwit bindt aan de 14 XUAS en activeert transcriptie van EGFP.
Het tweede minder wenselijke gebeuren is een enhancer-val. De minimale promotor voor EGFP valt onder de controle van een enhancer in de buurt van de integratieplaats, wat leidt tot productie van EGFP in afwezigheid van GAL vier, VP 16. Om onderscheid te maken tussen deze twee klassen van gebeurtenissen, werd een 14 X-U-A-S-M-R-F-P transgene lijn gemaakt die
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor insertionele mutagenese via gene trapping bij zebravis, waarbij Gal4-VP16 wordt gebruikt als primaire reporter en GFP/RFP als secundaire reporters. De procedure maakt de identificatie mogelijk van gene trap-nakomelingen die GFP en RFP co-expresseren, met een screeningsproces dat kan worden geschaald naar de omvang van het laboratorium.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Genetica
- Ontwikkelingsbiologie
- Transgene modellen
Achtergrond
- Insertionele mutagenese via gene trapping is een techniek die wordt gebruikt om mutaties in specifieke genen te creëren.
- Gal4-VP16 dient als een gevoelige reporter voor genexpressie.
- GFP en RFP worden gebruikt om gene trap-gebeurtenissen te visualiseren.
- De methode is erop gericht om ongewenste mutaties tijdens de integratie te minimaliseren.
Doel van het onderzoek
- Om mutante zebravissen te produceren voor functionele genanalyse.
- Om de gevoeligheid van de detectie van genexpressie te verhogen.
- Om een betrouwbare screeningsmethode voor gene trap-gebeurtenissen vast te stellen.
Gebruikte methoden
- Co-injectie van gene trap-vectoren en transposase-mRNA in zebravissenembryo's.
- Screening op GFP-fluorescentie drie dagen na bevruchting.
- Kruisen van F0-vissen met U-A-S-M-R-F-P testerlijnen om kiembaanoverdracht te verifiëren.
- Outcrossing van F1 om de F2-generatie op te stellen voor moleculaire karakterisering.
Belangrijkste resultaten
- Ongeveer 30% van de helderste embryo's werd geselecteerd voor verdere analyse.
- Ongeveer één op de tien F0-vissen produceerde gene trap-nageslacht.
- Gene trap-gebeurtenissen werden bevestigd door co-expressie van GFP en RFP.
- Integratiemechanismen werden geïdentificeerd, waaronder echte gene trap- en enhancer trap-gebeurtenissen.
Conclusies
- De methode genereert effectief zebravis-mutanten voor studies naar genfuncties.
- Hoge percentages van gene trap-integratie zijn cruciaal voor succesvolle resultaten.
- Deze aanpak maakt het mogelijk om gene trap-gebeurtenissen omkeerbaar te markeren voor verder onderzoek.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Insertionele mutagenese via gene trapping in zebravis maakt high-throughput functionele annotatie van genen in een gewervden systeem mogelijk, wat doelvalidatie en mechanische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. Het gebruik van Gal4-VP16 als primaire reporter verhoogt de gevoeligheid voor transcripten met een lage abundantie en stelt geconverteerde trap-lijnen in staat om te dienen als weefselspecifieke drivers voor transgene expressie, wat het onderzoeken van signaalpaden en fenotypische screening faciliteert. Deze benadering verbetert het voorspellende vertrouwen door genotypen te koppelen aan weefselspecifieke fenotypen zonder afhankelijk te zijn van evidente ontwikkelingsdefecten, wat bijzonder waardevol is voor genen met redundante of niet-essentiële functies.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & doelwitvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken via insertionele mutagenese, waarbij endogene genexpressie wordt gemarkeerd met Gal4-VP16 voor sensitieve detectie.
- Operationele waarde: Genereert reversibele gene trap-mutaties via loxP-geflankeerde cassettes, wat causale validatie van fenotype-genotype-relaties mogelijk maakt door middel van Cre-gemedieerde excisie.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door gevangen loci om te zetten in Gal4-drivers om de expressie van effector-transgenen in specifieke weefsels te sturen, waardoor de genfunctie in ziekte-relevante contexten wordt verduidelijkt.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve dual-reporter read-outs op (GFP/RFP co-expressie) om echte gene trap-gebeurtenissen te onderscheiden van enhancer trap-gebeurtenissen, waardoor de specificiteit van de assay wordt verbeterd.
- Operationele waarde: Vestigt een schaalbare kiemlijn-transmissiepijplijn waarbij ~10% van de gescreende F0-founders overdraagbare gene trap-allelen oplevert, wat bijdraagt aan de consistente generatie van mutante lijnen.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt de voorbereiding van gevalideerde biologische systemen voor downstream screening mogelijk door batches dubbel-positieve embryo's in te vriezen voor moleculaire identificatie van trap-loci via inverse PCR en 5' RACE.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Identificeert trap-mutaties in genen die coderen voor nucleaire, cytoplasmatische en membraaneiwitten, wat een brede doelbereik garandeert zonder voorkeur voor nucleaire lokalisatie.
- Operationele waarde: Faciliteert translationele continuïteit door F2-intercrosses mogelijk te maken om expressiepatronen te documenteren en embryo's te invriezen voor genotypering, wat preklinische validatieworkflows ondersteunt.
- Wetenschappelijke waarde: Bevordert mechanistische risicoreductie door omkeerbare markering van mutaties mogelijk te maken, waardoor causale gene trap-integraties kunnen worden onderscheiden van positionele effecten in fenotypische screens.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege mutagenese tot lead-identificatie, waarbij gene-trap-lijnen dienen als zowel mutante allelen als Gal4-drivers voor pathway-specifieke transgene expressie, wat iteratieve target-validatie en assay-verfijning ondersteunt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door endogene loci te labelen met Gal4-VP16 om expressiedynamiek in vivo te monitoren tijdens chemische of genetische perturbatie.
- Screening: Levert assay-ready, reproduceerbare kwantitatieve resultaten via GFP/RFP co-expressiescoring, wat gestandaardiseerde vergelijkingen mogelijk maakt tussen mutante en wildtype-condities over verschillende screeningscampagnes heen.
- Analytics: Genereert moleculaire read-outs (inverse PCR, 5' RACE) die precieze identificatie van gevangen genen mogelijk maken, wat bijdraagt aan datagedreven prioritering van targets.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt discovery aan preklinische continuïteit door embryo's te bewaren voor genotypering en expressieanalyse, waardoor fenotypische observaties worden gekoppeld aan gevalideerde genetische laesies.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een omkeerbaar, schaalbaar platform waarbij founder-vissen herhaaldelijk kunnen worden teruggekruist om F2-families te genereren, ter ondersteuning van longitudinale studies en het delen van reagentia tussen projecten.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door de detectie van genen met een lage expressie te verbeteren en weefselspecifieke transgene expressie mogelijk te maken zonder dat fenotypische penetrantie vereist is.
- Operationele waarde: Standardiseert de generatie van mutanten via gedefinieerde injectieratio's, fluorescentiegebaseerde sortering en screening op kiemlijntransmissie, waardoor de reproduceerbaarheid tussen laboratoria wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Vermindert het biologische risico bij de identificatie van lead-verbindingen door omkeerbare, allelspecifieke modellen voor targetvalidatie te bieden, waardoor fout-positieven door insertie-artefacten worden geminimaliseerd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk door de generatie van allelische series en fenotypische deconvolution, wat go/no-go-beslissingen ondersteunt op basis van mechanisch bewijs in plaats van enkel op basis van de ernst van het fenotype.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in micro-injectie bij zebravissen, fluorescentiescreening en het onderhoud van transgene lijnen.
- Afhankelijk van functioneel transposase-mRNA en DNA-preparatie van hoge zuiverheid, inclusief PB-wasstappen om RNA-contaminatie te voorkomen.
- Noodzaak van gestandaardiseerde kruisingsschema's met UAS-mRFP-reporterlijnen om gene-trap-events te onderscheiden van enhancer-trap-events via co-expressiescoring.
- Houdt rekening met aanpassingen voor genen die coderen voor gesecreteerde of membraanproteïnen, aangezien N-terminale fusies de nucleaire lokalisatie en transcriptionele activiteit van Gal4-VP16 kunnen belemmeren.
- Onderhevig aan praktische beperkingen in de efficiëntie van kiemlijntransmissie, waarbij de optimalisatie van F0-screening en de frequentie van terugkruisingen invloed heeft op de herstelsnelheid van mutanten.
