Ontcijfering Axonale Pathways van genetisch bepaalde groepen van neuronen in de Chick Neural Tube Door gebruik te maken In ovo Elektroporatie
2 mei 2010
Deze video laat zien hoe axonale paden van genetisch bepaalde groepen neuronen te visualiseren in de embryonale kuiken ruggenmerg gebruik te maken van In ovo Elektroporatie van de reportergenen onder de controle van specifieke enhancer elementen.
Hallo, ik ben Ham van het laboratorium van Dr. Review Klar van de afdeling medische neurobiologie aan de Hebreeuwse Universiteit van Jeruzalem. Hallo, ik ben Sophie Esman en ik kom ook uit het laboratorium van Lars. Vandaag gaan we u een procedure laten zien voor in vivo electroporatie en de open-book preparatie van het ruggenmerg.
Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om axonale trajecten van genetisch gedefinieerde neuronale populaties in het embryonale ruggenmerg te bestuderen. Laten we beginnen. Om deze procedure te starten, verplaatst u bevruchte witte leghenneneieren van kamertemperatuur naar een bevochtigde incubator, bij voorkeur met schommelende trays bij 37 tot 38 °C.
Het is belangrijk om de temperatuur en vochtigheid van de incubator te bewaken om levensvatbare en gesynchroniseerde embryo's te verkrijgen. De kiजemembryo's worden geëlektroporeerd wanneer ze het Hamburger-Hamilton-stadium (HH-stadium) 18 tot 20 hebben bereikt, wat een optimaal stadium is voor enhancer-afhankelijke specifieke expressie. In dit stadium staat de kop in een rechte hoek ten opzichte van de romp.
Tevens moeten er bij HH-stadium 18 tot 20 een groot aantal extra-embryonale bloedvaten zichtbaar zijn, zoals de anterieure en posterieure vitellijnvaten aan de rechter- en linkerzijde. De kiजemembryo's bereiken HH-stadium 19 tot 20 na 66 uur incubatie; haal de eieren op dat moment uit de incubator. Plaats de eieren na het verwijderen horizontaal en wacht vijf tot 10 minuten. Het embryo bevindt zich nu aan de bovenpool van het ei.
Voorafgaand aan de electroporatie bereiden de embryo's de Hank's-oplossing met 100 units per milliliter penicilline en 0,1 milligram per milliliter streptomycine. Bereid het gewenste DNA-mengsel voor bij twee tot vijf microgram per microliter en voeg enkele korrels fast green-kleurstof toe voor een eenvoudige visualisatie van het geïnjecteerde DNA. Zorg daarnaast dat een mondpipet, een steriele injectienaald, een klein schaartje en plakband klaarliggen.
Bereid microcapillairen voor door glazen capillairen met een diameter van 0,5 millimeter uit te trekken met een pipette-puller. Plaats de wolfraamelektroden in de micromanipulatoren en verbind de elektroden met de pulsgenerator. Stel de spanning op de pulsgenerator in op minus 30 volt, de lengte van elke puls op 50 milliseconden en het aantal pulsen op drie.
Ga over tot electroporatie voordat de embryo's worden blootgesteld en gehanteerd. Plaats een spuit bij de smalle pool van het ei en verwijder vijf tot zes milliliter albumine uit elk ei. De albumine wordt verwijderd om morsen te voorkomen.
Gebruik bij het snijden in de volgende stap de kleine schaar. Maak een ovaal venster aan de bovenzijde van het ei nadat het kiजenembryo is blootgelegd en bevochtig dit met 0,5 tot 1 mL hanks en penicilline-streptomycine-oplossing. Gebruik vervolgens een mondpipet om de glazen microcapillair te vullen.
Met een DNA-kleurstofmengsel moet een microcapillair van de juiste diameter gemakkelijk met DNA te laden zijn. Positioneer het embryo onder een binoculaar om het DNA in de neurale buis te injecteren. Plaats het embryo met de staart naar u toe.
In dit ontwikkelingsstadium is het ruggenmerg duidelijk zichtbaar, waardoor er geen contrasttechnieken nodig zijn. Het ruggenmerg is zowel aan het kop- als aan het staartuiteinde afgesloten. Maak echter met de microcapillaire puncties gaten in de neurale buis door deze onder een flauwe hoek te penetreren; een microcapillair die dun genoeg is en de juiste diameter heeft, moet de buis kunnen penetreren zonder deze te beschadigen.
Injecteer het DNA met behulp van een mondpipet. Een microcapillair van de juiste diameter dient het DNA af te geven bij een gelijkmatige uitademing. De groene kleurstof moet zich verspreiden vanaf de punt van de staart tot aan de blaasjes van de ontwikkelende hersenen.
Inject tot de neurale buis is gevuld; DNA-electroporatie is vereist om het geïnjecteerde DNA in de cellen te doen dringen. Plaats eerst de elektroden parallel aan de neurale buis en zo dicht mogelijk bij de buis zonder deze aan te raken. Zorg ervoor dat de elektroden bedekt zijn met vloeistof om de elektrische geleidbaarheid tijdens de puls te waarborgen.
Normaal gesproken is de Hank-oplossing die direct na het blootstellen van het embryo wordt toegevoegd voldoende. Indien dit niet het geval is, voeg dan vlak voor de puls een druppel Hank-oplossing toe terwijl de elektroden zijn geplaatst en ondergedompeld in de vloeistof, voer de puls uit voor de elektroporatie, en verwijder vervolgens voorzichtig de elektroden en sluit het venster en het ei af met tape. Het is belangrijk om het ei volledig af te sluiten om uitdroging van het embryo tijdens de daaropvolgende incubatieperiode te voorkomen.
Plaats het ei terug in de incubator en incubeer dit totdat het kikenbryo de embryonale ontwikkelingsfase van dag zes (E6) heeft bereikt, het moment waarop beeldvorming plaatsvindt nadat het ge-elektroporeerde embryo dag zes (E6) heeft bereikt. Verwijder het embryo drie dagen na electroporatie met een fijne schaar uit het ei en plaats het in een met silicone gecoate Petrischaal met PBS.
Snijd de membranen weg en span het embryo aan de ventrale zijde op met pinnen die in de siliconen zijn geduwd om het op zijn plaats te houden. Maak met een scherpe wolfraam-microcapillair een longitudinale incisie langs de dakplaat, vanaf de ruitbrein tot aan de staart.
Maak twee extra longitudinale incisies aan beide zijden van het ruggenmerg, waarbij de dorsale wortelganglia of DRG's van het ruggenmerg worden losgemaakt. Maak de floor plate los van het weefsel, beginnend bij de staart tot aan de hindbrain, terwijl het ruggenmerg intact blijft. Gebruik tot slot een fijne schaar om het ruggenmerg in een transversale sectie bij de hindbrain door te snijden en scheid het ruggenmerg van het lichaam.
Nu het ruggenmerg is geïsoleerd, wordt het in een nieuwe siliconen gecoate Petrischaal met PBS uitgespreid. Gebruik spelden om het ruggenmerg van de achterhersenen tot aan de staart vast te zetten, zodat een plat preparaat (flat mount) ontstaat. Fixeer het ruggenmerg gedurende één uur bij kamertemperatuur in 4% par Formaldehyde in PBS. Voer de immunokleuring uit volgens de immunohistochemische procedure, zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol, om het ruggenmerg open te monteren. Bereid het preparaat voor voor beeldvorming.
Breng vet of silicone in een rechthoekige vorm aan op een objectglas en druppel PBS binnen de rechthoek. Gebruik een pincet om het ruggenmerg in het midden van de rechthoek te plaatsen en uit te strekken, en trek de vloeistof eromheen weg. Breng met een pipet één tot twee druppels monteermedium aan op het ruggenmerg en dek dit af met een dekglas.
Oefen druk uit op het dekglas om luchtbellen te voorkomen. Bewaar de objectglazen in het donker bij vier graden Celsius.
Inspecteer het ruggenmerg met behulp van confocale microscopie. Hier zijn enkele representatieve resultaten van axonale rejecties van spinale interneuronen van kuikens in controle-experimenten waarin RFP wordt tot expressie gebracht in alle neuronen door gebruik te maken van een ubiquitair enhancer-element van CMV; de meeste neuronen en hun axonen zijn gelabeld. Het is onmogelijk om het axonale traject van neuronale subpopulaties te ontcijferen.
Wanneer echter specifieke versterkingselementen worden toegepast, wordt een gedefinieerd axonaal pad van een specifieke subpopulatie DI twee neuronen in dit voorbeeld zichtbaar. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u een neurale buis van een embryo kunt elektroporeren met een specifieke neuronale enhancer bij E3 en hoe u een spinal cord in de open-book-configuratie kunt prepareren bij E6. Bij het uitvoeren van deze procedure dient u zorgvuldig en geduldig te werk te gaan.
Dit was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten. Veel succes.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze video demonstreert een procedure voor het visualiseren van axonale banen van genetisch gedefinieerde neuronen in het embryonale ruggenmerg van een kuiken met behulp van in ovo elektroporatie. De methode stelt onderzoekers in staat om axonale trajecten effectief te bestuderen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van axonale banen is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- In ovo electroporatie is een techniek die wordt gebruikt om reportergenen te introduceren.
- Het embryonale ruggenmerg van de kip dient als model voor het bestuderen van neuronale ontwikkeling.
- Genetisch gedefinieerde neuronale populaties kunnen inzicht bieden in specifieke neurale circuits.
Doel van de studie
- Om axonale banen in het embryonale ruggenmerg te visualiseren.
- Om in ovo elektroporatie te gebruiken voor genexpressiestudies.
- Om het begrip van neuronale ontwikkeling en connectiviteit te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Breng bevruchte kippeneieren over naar een bevochtigde incubator.
- Handhaaf de incubatie bij 37 tot 38 °C.
- Voer in ovo electroporatie uit om reportergenen te introduceren.
- Bereid spinal cord open book preparaten voor voor visualisatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van axonale banen in het ruggenmerg.
- Demonstratie van de effectiviteit van in ovo electroporatie.
- Inzicht in de trajecten van genetisch gedefinieerde neuronale populaties.
- Vestiging van een betrouwbare methode voor het bestuderen van neuronale ontwikkeling.
Conclusies
- De methode biedt een waardevol hulpmiddel voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- In ovo electroporatie is effectief voor genoverdracht in embryonale modellen.
- Inzicht in axonale banen kan studies naar de vorming van neurale circuits informeren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Deze methode maakt een nauwkeurige visualisatie van axonale trajecten in genetisch gedefinieerde neuronale populaties mogelijk, waarmee een belangrijke uitdaging bij targetvalidatie wordt aangepakt, waarbij bilaterale labeling het onderscheid tussen ipsilaterale en contralaterale projecties vertroebelt. Door de expressie van de reporter te beperken tot één zijde van de neurale buis via unilaterale in ovo elektroporatie, kunnen onderzoekers neuronale circuit-hypotheses al vroeg in de ontdekkingsfase mechanistisch valideren. De aanpak vergroot de voorspellende betrouwbaarheid bij de selectie van targets door pathway-specifieke connectiviteitspatronen te verduidelijken die relevant zijn voor modellen van neuro-ontwikkelingsziekten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door axonale projecties van specifieke neuronale subpopulaties te isoleren die gedefinieerd worden door enhancer-gestuurde reporters.
- Operationele waarde: Biedt unilaterale labeling om ipsilateraal en contralateraal projecterende axonen te onderscheiden, waardoor ambiguïteit bij circuitmapping wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het biologisch de-risking van targets door te verduidelijken of een neuronale populatie excitatoire of inhibitoire paden activeert die cruciaal zijn voor het ziektemechanisme.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare data over axonale trajecten als fenotypische readout voor het screenen van genetische of farmacologische modulatoren van neuronale begeleiding.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare whole-mount preparaten die compatibel zijn met confocale beeldvorming met hoge resolutie en geautomatiseerde analysepipelines.
- Schaalbaarheidswaarde: Maakt gebruik van een kiजembyo-model dat schaalbaar is voor het testen van enhancer-activiteit of electroporatie-efficiëntie onder meerdere condities.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Brengt ziekterelevante axonale trajecten in kaart in vertebrale ruggenmergmodellen, wat afstemming mogelijk maakt met biomarkers voor menselijke neuro-ontwikkelingsstoornissen.
- Mechanistische continuïteit: Slaat een brug tussen targetvalidatie in de ontdekkingsfase en preklinische beoordeling van geneesmiddeleffecten op circuitniveau op axonale groei of geleiding.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Informeert go/no-go-beslissingen door te onthullen of een target specifieke projectiepatronen moduleert die gekoppeld zijn aan functioneel herstel of pathologie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het genereren van target-hypotheses tot de identificatie van lead-verbindingen, en biedt mechanistische inzichten die voorafgaan aan de ontwikkeling van functionele assays en de afstemming van translationele biomarkers ondersteunen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van enhancer-specifieke genexpressie bij het definiëren van neuronale subpopulaties en hun axonale trajecten.
- Screening: Maakt assay-klare biologische systemen mogelijk met gestandaardiseerde, unilaterale reporterexpressie voor het evalueren van effecten van verbindingen op axonale geleiding.
- Analytics: Levert kwantitatieve ruimtelijke read-outs van axonale projectiepatronen, wat vergelijkingen tussen genetische condities of behandelcondities faciliteert.
- Translationeel Onderzoek: Legt een verbinding met preklinisch werk door ziekterelevante modellen van axonale paden vast te stellen voor biomarkercorrelatie.
- Enterprise Reuse: Creëert een herbruikbaar platform voor iteratieve tests van genetische constructen, enhancerelementen of electroporatieparameters over meerdere neuronale doelwitten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door de directionaliteit van axonale projecties te bepalen, een cruciale factor bij het beoordelen van circuitspecifieke effecten van geneesmiddelen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie door gedefinieerde electroporatieparameters (voltage, pulslengte, aantal) en gefaseerde behandeling van embryo's.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van targets waarvan de axonale paden niet overeenkomen met de gewenste therapeutische mechanismen.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door targets te identificeren die specifieke projectiepatronen moduleren die relevant zijn voor klinische eindpunten bij neuro-ontwikkelingsindicaties.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in embryologische technieken, waaronder embryo-stadiëring, micro-injectie en de optimalisatie van electroporatieparameters.
- Is afhankelijk van instrumentatie zoals pulsgeneratoren, micromanipulatoren, wolfraamelektroden en confocale microscopie voor beeldvorming.
- Vereist standaardisatie van de DNA-concentratie, de selectie van enhancer-elementen en de plaatsing van elektroden tussen gebruikers en laboratoria voor reproduceerbare resultaten.
- Omvat overwegingen met betrekking tot adaptatie bij het overdragen van het model naar andere vertebraten-systemen of neuronale typen buiten de spinale interneuronen.
- Praktische beperkingen zijn onder meer de gevoeligheid van de embryonale levensvatbaarheid voor incubatieomstandigheden en de technische uitdaging om uniforme unilaterale electroporatie te bereiken zonder beschadiging van de neurale buis.
