Identificatie van groeiremming fenotypes geïnduceerd door expressie van bacteriële type III Effector in gist

Om dit protocol te starten, selecteert u een vector voor de expressie van uw gewenste bacteriële effector. In gist en de giststam wordt de vector vervolgens getransformeerd in gistcellen. Vervolgens wordt de expressie van de effector geïnduceerd.

Geïnduceerde cellen worden gelyseerd voor een daaropvolgende western blot-analyse om de expressie van de effector te verifiëren. Na bevestiging van de expressie van de effector worden de cellen gekweekt en worden seriële verdunningen in een factor tien op represserende en inducerende media gespot. Tot slot wordt na twee tot drie dagen de gistgroei geanalyseerd.

Hallo, ik ben Do Solomon van het laboratorium van Dr. Guido Cesa van de Afdeling Plantenwetenschappen aan de Universiteit van Tel Aviv. Vandaag laten we u een procedure zien voor de identificatie van groeiremmingsfenotypes die worden geïnduceerd door de expressie van bacteriële type drie effectoren in gist. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de functie van type drie effectoren van gramnegatieve pathogene bacteriën te bestuderen, en het is een hulpmiddel dat ons ondersteunt bij de identificatie van de TIC-doelen van de effector.

Laten we beginnen. Bij het ontwerpen van een gist-systeem dat geschikt is voor de expressie van de type drie-effectoren van belang, moeten verschillende belangrijke factoren worden overwogen en geoptimaliseerd. De eerste factor is de promotor die de expressie van de effectoren aanstuurt.

Aangezien bacteriële type drie-effectoren toxisch kunnen zijn voor gistcellen, moet een induceerbare promotor worden gebruikt om hun expressie te beheersen. In dit experiment maken we gebruik van de GAL1-promotor. De tweede factor is het kopienummer van het effectorgen.

Hoge expressieniveaus worden bereikt wanneer het effectorgen wordt gedragen door een twee-micron-plasmide. Intermediaire expressie wordt verkregen door gebruik te maken van een centromeer-bevattend plasmide, en lage expressie wordt bereikt wanneer het effectorgen door homologe recombinatie in het gistgenoom wordt geïntegreerd. Een derde factor om rekening mee te houden is de epitope-tag die wordt gebruikt om de eiwitexpressie te verifiëren in gevallen waarin antilichamen tegen de betreffende effector niet beschikbaar zijn.

Veelgebruikte tags zijn M hemagglutinine HA of flag, waarvoor betrouwbare commerciële antilichamen beschikbaar zijn. Wij raden aan om slechts één kopie van de tag te gebruiken om ongewenste nadelige effecten op de structuur en activiteit van het effectorproteïne te minimaliseren. Ten slotte moet de giststam die voor expressie wordt gebruikt, tropisch zijn voor de selecteerbare marker van de expressievector.

Om gistcellen voor transformatie te kweken, pikt u een gistkolonie van een verse plaat en inoculeert u drie milliliter YPD in een polypropylene buis van 15 milliliter met een vortex. Plaats de cultuurbuis kort in een roller en incubeer deze overnight bij 30 °C met constante rotatie. Verwijder de volgende ochtend de cultuur uit de roller en centrifugeer deze bij 800 Gs gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder na centrifugatie het supernatant volledig en resuspendeer de cellen in één milliliter Resus suspensiebuffer door ongeveer 10 seconden te vortexen op maximale snelheid. Draag voor elk te transformeren plasmide en een extra controle-transformatie 100 microliters van de cel-suspensie over naar een microcentrifugebuisje. Voeg vijf microliters enkelstrengs zalmsperma-DNA en 250 tot 500 nanogram plasmide-DNA toe aan elk buisje, behalve aan het controlebuisje.

Voeg vervolgens voorzichtig 650 µL transformatieoplossing toe aan elke buis en vortex deze. Incubeer de buizen 30 minuten bij 30 °C op een roller. Wanneer de incubatie is voltooid, voegt u 70 µL DMSO toe aan elke buis en mengt u deze door de buizen 10 tot 15 keer te inverteren om te voorkomen dat de cellen kapotgaan.

Vortex de buisjes niet. Plaats de buisjes in een voorverwarmd waterbad van 42 °C en incubeer gedurende 15 minuten. Verwijder de buisjes na 15 minuten uit het waterbad en plaats ze onmiddellijk gedurende twee minuten op ijs.

Zodra de buisjes zijn afgekoeld, worden de cellen geoogst door middel van centrifugatie, waarna een pipetteur wordt gebruikt om het viskeuze supernat zorgvuldig te verwijderen. Resuspendeer elke pellet in 150 µL steriel dubbel gedestilleerd water en verspreid de celsuspensie op een plaat met het juiste selectieve medium. Laat de platen twee minuten openstaan om te drogen in een laminaire flowkast.

Plaats daarna de platen gedurende twee tot drie dagen in een incubator op 30 °C om de gistcellen te laten groeien. Inoculeer voor het bereiden van een eiwitextract drie milliliters van het geschikte represserende medium met een gistkolonie van een verse plaat en vortex deze. Plaats de cultuurbuis de volgende dag kort in een roller op 30 °C.

Verwijder de cultuur van de roller en centrifugeer 5 minuten bij 800 Gs op kamertemperatuur, verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet. In drie milliliter steriel DDW mengen door vortexen, opnieuw centrifugeren, het supernatant verwijderen en de cellen resuspenderen in drie milliliter steriel DDW. Draag nu 200 microliter van de celsuspensie over naar een nieuwe buis van 15 milliliter die drie milliliter van het geschikte inductiemedium bevat, en meng dit door vortexen.

Plaats de buis in een roller en incubeer deze een nacht bij 30 °C. Breng de volgende ochtend één milliliter van de cultuur, of meer bij culturen met een lage dichtheid, over naar een microcentrifugebuis. Oogst de cellen door centrifugatie bij 800 ×g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur; werk vanaf dit punt in een zuurkast om het inademen van toxische Beamer capto ethanol-dampen te voorkomen.

Verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en resuspendeer de celpellet in 100 µL ijskoude lysisoplossing. Meng krachtig door te vortexen en incubeer 30 minuten op ijs. Bepaal tijdens deze incubatie van 30 minuten het volume aan normaal zoutzuur dat nodig is om 100 µL lysisbuffer te titreren naar een pH van 9 tot 10.

Voer dit uit door verschillende volumes zoutzuur toe te voegen aan 100 µL lysisbuffer in 10 verschillende buisjes en controleer de pH van de oplossing met een pH-indicatorstrip aan het einde van de incubatie bij het juiste volume zoutzuur in het lysaat en meng door te vortexen. Voeg vervolgens 50 µL van drie x monsterbuffer toe aan het lysaat en meng door te vortexen; prik met een naald een gaatje in de dop van het microcentrifugebuisje en kook de lysaatoplossing vijf minuten op een warmteblok. Laat de oplossing na het koken twee minuten afkoelen bij kamertemperatuur.

Vortex vervolgens de lysaatoplossing en centrifugeer deze 10 seconden. Het lysaat is nu gereed voor immuunbloedanalyse om de cellen voor de spotting assay voor te bereiden. Kweek de volgende dag drie milliliter culturen van elke stam zoals eerder beschreven.

Bereid twee platen voor met synthetisch compleet medium zonder leucine. Het medium van de ene plaat moet worden aangevuld met 2% glucose en dat van de andere plaat met 2% lactose en 1% raffinose. Droog de platen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in een steriele laminaire flowkast.

Oogst de cellen en resuspendeer elk celpellet in drie milliliter steriel DDW. Herhaal de centrifugatiestap en resuspendeer de cellen opnieuw in drie milliliter steriel DDW. Bepaal de optische dichtheid of OD van elke cultuur en bereid vervolgens cellesuspensies van één milliliter met een OD 600 van één voor in steriele microfiche-buisjes.

Bereid vervolgens drie tienvoudige seriële verdunningen voor van elke cel-suspensie met behulp van drie steriele microtubes gevuld met 900 microliters steriel DDW. Plaats de droge platen op een raster en spot voor elke cultuur 10 microliters van de vier opeenvolgende verdunningen. Laat de platen na het spotten enkele minuten openstaan in de zuurkast.

Wanneer de vlekken droog zijn, worden de platen afgedekt en geplaatst in een incubator van 30 degree Celsius voor twee tot drie dagen. Nu tonen we de resultaten van een gist-spotting assay voor de detectie van groeiremming. Fenotypes geïnduceerd door de expressie van type drie effectoren hier, de type drie effectoren A-V-R-P-T-O hop, AA one one en AAV RE one van de bacterie.

Pseudomonas-effectoren van onze tomaat werden tot expressie gebracht vanuit een centromeer-bevattend plasmide in een giststam op represserend medium. Giststammen die het plasmide voor de expressie van AVRpto en HOPAA1a bevatten, vertoonden een soortgelijke groei als de controlestam met een lege vector. Terwijl gist met AVRE1 een licht verminderde groei vertoonde, waarschijnlijk door lekkage van de GAL1-promotor en de hoge cytotoxiciteit van AVRE1, veroorzaakte de expressie van zowel AVE1 als HOPAA1a onder inducerende condities een drastisch groeiremmend fenotype, wat weerspiegeld werd door het ontbreken van kolonies bij elke verdunning. In contrast hiermee oefende de expressie van AVRpto geen groeiremmend effect uit.

We hebben zojuist aangetoond hoe groeiremmingsfenotypen kunnen worden geïdentificeerd die worden veroorzaakt door de expressie van bacteriële type drie-effectoren in gist. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de expressievector en de giststam zorgvuldig moeten worden gekozen, aangezien beide de resultaten drastisch kunnen beïnvloeden. Denk er daarnaast aan om in alle stappen van de procedure vers getransformeerde kolonies te gebruiken.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.