Het bestuderen van de effecten van Matrix stijfheid op de cellulaire functie gebruik Acrylamide-based Hydrogelen

Om de in vivo weefselcompliantie te modelleren met behulp van acrylamidehydrogelen. Dit wordt bereikt door eerst reactieve onderste dekglasjes en gesiliconiseerde bovenste dekglasjes te maken. De tweede stap van de procedure is het gieten en vervaardigen van de acrylamidehydrogelen.

De derde stap van de procedure is het crosslinken van het gekozen extracellulaire matrixeiwit aan de hydrogel. De laatste stap van de procedure is de incubatie en analyse van de cellen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen hoe variërende compliantie van de extracellulaire matrix in vitro het celgedrag reguleert, door middel van analyse met immunofluorescentiemicroscopie, real-time kwantitatieve PCR en western blotting.

Vandaag laten we u de procedure zien voor het genereren en gebruiken van acrylamide-hydrogels. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om te bestuderen hoe de stijfheid van de extracellulaire matrix de celmorfologie, celsignalering en proliferatie reguleert. Laten we beginnen.

Begin deze procedure met het genereren van reactieve dekglasjes. Plaats eerst een laag parafilm op de onderste helft van een Petri-schaal van 150 millimeter. Breng vervolgens maximaal negen geautoclaveerde dekglasjes van 25 millimeter over naar de parafilm en bedek deze met 1 milliliter 0,1 molar natriumhydroxide.

Incubeer de dekglasjes gedurende drie minuten. Aspireer na incubatie het natriumhydroxide met een vacuümsysteem in een zuurkast. Pipetteer 0,5 milliliters 3-aminopropyltrimethoxysilaan of 3-APTMS op elk dekglasje. Incubeer de dekglasjes gedurende drie minuten en aspireer vervolgens het 3-APTMS. Neem voorzorg om niet te lang te incubeer om de vorming van schuim op het dekglas te voorkomen.

Dekglas na de behandeling. Spoel de dekglazen eenmaal met 20 milliliters gedeïoniseerd water in hetzelfde schaaltje. Verwijder de dekglazen uit het schaaltje met een gebogen pincet en breng ze met de behandelde zijde naar boven over naar een nieuw schaaltje van 150 millimeter.

Was de dekglasjes vervolgens opnieuw met gedeïoniseerd water en plaats ze gedurende 10 minuten op de rocker. Verwijder na de incubatie het water en was ze nog twee keer extra. Het is zeer belangrijk om al het A-P-T-M-S te verwijderen, zodat dit niet reageert met het glutaaraldehyde en 10 minuten voor het gebruik van het glutaaraldehyde een troebele witte neerslag achterlaat.

Breng met een gebogen pincet de dekglasjes over naar een schoon schaaltje met een laag parafilm en zuig eventueel resterend vocht af met een vacuümlijn. Bedek vervolgens elk dekglasje volledig met 0,5 milliliters 0,5% glutaraldehyde in steriel gedeïoniseerd water om de drie A-P-T-M-S en de polyacrylamidegel te crosslinken. Incubeer de dekglasjes gedurende 30 minuten in een zuurkast. Zuig daarna de glutaraldehydespoeling af en was de dekglasjes opnieuw met gedeïoniseerd water.

Droog vervolgens de dekglasjes volledig. Voeg nieuwe dekglasjes toe aan een Falcon-buis van 50 milliliter met een 10% surface seal-oplossing in chloroform en schud deze gedurende ten minste 10 minuten. Giet de surface seal-oplossing af en laat de glasjes aan de lucht drogen.

Leg de dekglasjes op Kim wipes in de biologische veiligheidskast waar de hydrogels zullen worden bereid om te beginnen met de bereiding van de hydrogels. Gebruik gebogen pincetten om de dekglasjes met de reactieve zijde naar boven over te brengen naar een vel parafilm dat op het oppervlak van de biologische veiligheidskast is vastgeplakt. Zorg ervoor dat de dekglasjes plat op het parafilmoppervlak liggen.

Bereid vervolgens een verzadigde hydroxy CIN-hulpstof- of NHS-oplossing in tolueen door een kleine hoeveelheid NHS op te lossen in voldoende tolueen. Voeg voor de specifieke experimenten kleine hoeveelheden NHS toe totdat de NHS niet langer oplost. De verzadigde oplossing is gewoonlijk troebel en roze.

Bereid vervolgens de acrylamide, BIS-acrylamide, water en een PS voor om het gewenste acrylamidepercentage te bereiken. Voeg de reagentia toe aan de microcentrifugebuisjes zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Doe dit vervolgens aliquot voor aliquot.

Voeg de NHS en TM toe. Vortex de buis kortstondig en giet onmiddellijk over drie tot vijf gels, waarbij 140 µL per dekglas wordt gebruikt in de biologische veiligheidskabinetten. Plaats snel het GESILICONISEERDE 25 mm dekglas bovenop elke gel voordat de polymerisatie begint.

Door het toevoegen van het bovenste dekglas wordt het acrylamide over het onderste dekglas verspreid. Incubeer deze sandwich bij kamertemperatuur totdat het acrylamide polymeriseert om vast te stellen wanneer de polymerisatie is voltooid. Controleer de resterende acrylamide-oplossing in het microcentrifugebuisje.

De polymerisatie duurt enkele minuten voor stijve gels en iets langer voor zachte gels. Zodra de polymerisatie is voltooid, tilt u de sandwich voorzichtig op met steriele handschoenen. Schuif vervolgens het bovenste dekglas weg totdat het over de gepolymeriseerde gel hangt.

Wip vervolgens de afdekking open. Schuif de gel eraf en gooi het bovenste dekglas weg. Plaats elk onderste gel-dekglas, hierna aangeduid als de hydrogel, in een six-well plaat.

Voeg vervolgens twee milliliters fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS toe per putje van een zes-wells plaat. Was vervolgens de hydrogels met PBS en incubeer deze vijf minuten op een rocker. Herhaal deze wasstap twee keer.

Om met het experiment te beginnen, wordt elke hydrogel bedekt met twee milliliters van een fibronectine-oplossing of een ander extracellulair matrixeiwit. Incubeer het eiwit overnight bij 4 °C op de hydrogel om covalente binding aan de hydrogel mogelijk te maken; aspireer na de overnight incubatie de ECM-oplossing. Blok vervolgens de niet-reactieve NHS met 1 mg/mL hitte-geactiveerd vetzuurvrij bovien serumalbumine in serumvrij medium en incubeer dit gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C.

Was na incubatie de hydrogels eenmaal met steriele PBS. Zaai vervolgens de cellen uit op de hydrogel in het geschikte kweekmedium dat foetaal runderserum bevat.

Gevestigde embryonale muis fibroblasten worden gebruikt. Bepaal het aantal cellen dat op de hydrogel moet worden gezaaid op basis van de mate van celspreiding en confluentie die vereist is voor het experiment. Voor western blot- en kwantitatieve PCR-analyse zijn ongeveer 10⁵ cellen nodig.

Incubeer de cellen vervolgens onder de passende condities voor het specifieke celtype. Na de incubatieperiode wordt het celproteïne of mRNA geëxtraheerd, afhankelijk van de behoefte.

Pipetteer druppels van 100 µL lysisbuffer op een vel parafilm op de laboratoriumbank, met ongeveer twee tot drie centimeter tussen elke druppel. Verwijder vervolgens voorzichtig elke hydrogel door het onderste dekglas uit de well te tillen. Gebruik hiervoor gebogen pincet en plaats de zijde met de cellen naar beneden op de druppels.

Incubeer de cellen precies één minuut met de lysisbuffer. Verwijder tot slot de dekglasjes en breng de lysisbuffer over naar een microcentrifugebuisje. Bij RNA-extractie kan men alternatief elke hydrogel overbrengen naar een nieuwe zes-wells plaat en één milliliter triazol per well toevoegen.

Incubeer de gels gedurende drie minuten na de incubatie. Verwijder de triazooloplossing voor bewaring in een microcentrifugebuisje. Grondige wassing van de dekglasjes na toevoeging van A-P-T-M-S is een belangrijke stap bij het produceren van reactieve dekglasjes.

Correct gewassen en droge dekglasjes zijn vrij van elk residu van neerslag. A-P-T-M-S zal reageren met het glutaaraldehyde en een wit troebel neerslag vormen. Indien er neerslag optreedt, moet de volledige procedure worden herhaald aangezien het dekglasje niet langer bruikbaar is.

Na de vorming van de hydrogel en de coating met ECM-eiwitten worden de cellen gedurende de nacht uitgezaaid. Er is een duidelijk verschil tussen cellen die uitspreiden op stijve versus zachte hydrogelen, zoals te zien is bij de phalloidine-kleuring; muis embryonale fibroblasten spreiden zich in grotere mate uit op stijve hydrogelen vergeleken met zachte hydrogelen. Inderdaad blijven de meeste cellen die aan een zachte hydrogel hechten compact en hechten ze minder efficiënt.

Representatieve resultaten van de kwantitatieve PCR van de mRNA-niveaus van cycling D1 in embryonale fibroblasten van muizen tonen aan dat cycling D1 significant is opgereguleerd op een stijve matrix, maar niet op een zachte matrix. Dit suggereert dat de stijfheid van de matrix de progressie van de celcyclus in vitro reguleert. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u hydrogels met verschillende stijfheden kunt genereren om in vivo fysiologische condities na te bootsen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om extra reactieve dekglasjes te maken, aangezien er ongelukken en fouten zullen optreden.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.