Gramicidine op basis van fluorescentie test, voor het bepalen van kleine moleculen Potentieel voor het wijzigen van lipide bilaag Properties

Het algemene doel van deze procedure is om door geneesmiddelen geïnduceerde veranderingen in de eigenschappen van de dubbellaag te meten, zoals waargenomen door eiwitten die de dubbellaag overspannen. Dit wordt bereikt door eerst Fluor-geladen, grote unilamellaire vesikels te maken. De tweede stap van de procedure is het doperen van de vesikels met gramine.

De derde stap van de procedure is het toevoegen van een externe quencher en het meten van de quenching-snelheid van de interne fluoro. Vier. De laatste stap van de procedure is het kwantificeren van de verandering in fluor-quenching per gramine-activiteit door een stretched-exponentiële functie te fitten op het fluorescentietijdverloop. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen om te evalueren of amfi-bestanden de eigenschappen van de lipide dubbellaag kunnen veranderen.

Hallo, ik ben Ola Anderson. Hallo, ik ben Helson. Hoi, ik ben Richie Kapo.

En ik ben Leah Sanford uit het laboratorium van Dr. Olaf Anderson van de afdeling Fysiologie en Biofysica aan het Weill Cornell Medical College. Vandaag laten we u een procedure zien voor het meten van veranderingen in de eigenschappen van lipidendubbellaagen. In ons laboratorium gebruiken we deze procedure om de effecten van geneesmiddelen en kleine moleculen op de eigenschappen van lipidendubbellaagen te bestuderen.

Laten we beginnen. Haal op de eerste dag van deze procedure de lipide uit de vriezer en laat deze equilibreren tot kamertemperatuur. Zodra de equilibratie voltooid is, voegt u 0,6 milliliter van een 25 milligram per milliliter lipide- en chloroformoplossing toe aan een ronde bodemkolf van 25 milliliter. Droog vervolgens de oplossing onder stikstofgas terwijl de kolf continu wordt geroteerd, totdat al het chloroform is verdampt.

En een dunne witte lipidelaag bedekt de gehele onderste helft van de fles; droog de lipiden verder in een vacuümdessicator gedurende de nacht. Bereid een oplossing van 100 millimolaire natriumnitraat, 25 millimolaire A NTS en 10 millimolaire HEPs bij pH 7. Vermijd bij het aanpassen van de pH van deze oplossing alle chloridehoudende oplossingen.

Aangezien de thallium-quencher op dag twee een onoplosbaar complex vormt met het chloride, rehydrateer de lipiden in 1,67 milliliter van deze elektrolytenoplossing om een 10 millimolaire lipidesuspensie te verkrijgen. Zodra de juiste concentratie is bereikt, wordt de suspensie afgedekt met parafilm en grondig gevortext; bescherm de monstername tegen licht met folie en laat het gedurende de nacht rijpen bij kamertemperatuur.

Sonicate het mengsel op dag drie gedurende één minuut in een sonicator op laag vermogen. Vries vervolgens de sample in en ontdooi deze door het vijf minuten op droogijs te plaatsen, gevolgd door vijf minuten in warm water; herhaal deze vries-dooi-cyclus vier tot vijf keer. Extrudeer de lipidsuspensie met behulp van een Avanti mini-extruder.

Stel de mini-extruder in met een polycarbonaatfilter van 0,1 micron en filtersteunen; extrudeer de suspensie 21 keer heen en weer zodat er een bijna transparante suspensie in de tegenoverliggende spuit terechtkomt, wat resulteert in een suspensie van grote unilamellaire vesikels of LUV-suspensie. Verwijder extern A NTS door de geëxtrudeerde suspensie over een PD 10 desaltingkolom te leiden die is geëquilibreerd met natriumbuffer. Voeg 1,5 milliliter van de LUV-suspensie plus één milliliter natriumbuffer toe aan de kolom.

Nadat de oplossing volledig in de kolom is opgenomen, worden de liposomen geëlueerd met drie milliliters natriumbuffer en wordt het eluaat opgevangen. De resulterende A NTS-gevulde LUV-voorraadoplossing moet ongeveer vier tot vijf millimolair lipide bevatten en er doorschijnend melkwit uitzien.

Bescherm de oplossing tegen licht met folie en bewaar deze bij 13 °C; vortex volledig 24 uur voor gebruik. De A NTS gevulde LUV-stockoplossing. Aangezien UUV's een dichtheid hebben van meer dan 1 g/mL en kunnen sedimenteren.

Verdun vervolgens de A NTS-gevulde LUV-stamoplossing 1 op 20 met natriumbuffer. Incubeer driekwart van de liposomen met 260 nanogram abidin in DMSO. Voeg aan het resterende kwart hetzelfde volume DMSO zonder gramine toe.

Om de oplosmiddelconcentratie in alle monsters constant te houden, laat u het gramin 24 uur lang equilibreren tussen de binnenste en buitenste monolaag van de lipidevesikels bij 13 °C. Hier wordt een applied photophysics SX point 20 stopped flow spectrofluorimeter met temperatuurregeling gebruikt om de snelheid van fluorescentiedovend (quenching) te meten. Schakel de instrumenten een uur van tevoren in om de opwarmtijd van het instrument mogelijk te maken.

De spleet met rapporteurs voor excitatie moet op 1/1 staan en er moet een 455 nanometer high-pass filter worden gebruikt voor het registreren van emissie met de pro data SX-software. Stel eerst de registratiecondities in en zet de excitatiegolflengten van de monochromator op 352 nanometer. Gebruik de drukvasthoudinstelling.

Stel de tijd in op één seconde en het aantal punten op 5 000. Pas het aantal herhalingen aan naar negen voor buffer-runs en naar 13 voor quencher-runs. Monitor de temperatuur in het check drive-profiel van de Essex-software.

Het aandrijfvolume moet worden ingesteld op 120 µL, wat 60 µL uit elke spuit mengt. Dit geeft een dode tijd van ongeveer 1,2 ms. Stel de hoogspanning of versterking van de fluorescentiedetector in op ongeveer 420 V.

Het doel is om een fluorescentiemeting van ongeveer acht te verkrijgen; laat de eerder bereide A NTS-geladen UUV's gedurende 10 minuten equilibreren bij 25 °C in het donker. Zodra ze geëquilibreerd zijn, vortex het monster en laad het vervolgens in de linker spuit. Laad in de rechter spuit ofwel natriumbuffer of thallium-quencher.

Verwijder eventuele luchtbellen door de spuiten heen en weer te bewegen. Beide spuiten moeten gelijkmatig gevuld zijn. Registreer vóór het sluiten van de kleppen voor het allereerste monster de fluorescentie met natriumbuffer.

Herhaal dit vier keer en pas de gain naar behoefte aan. Herhaal dit vervolgens nog vijf keer voor de overige monsters. Registreer negen herhalingen met natriumbuffer.

Vervang de natriumbuffer door de thallium-quencher en registreer 13 herhalingen. Spoel af met water en ga verder met de volgende monstercontroles. Neem monsters op zonder gramine en met oplosmiddel, en zonder gramine en met de maximale verbindingconcentratie.

Nadat zowel gramine als het oplosmiddel via de fluorescentie-assay zijn geanalyseerd, worden de gegevens in de MATLAB-software ingelezen voor analyse. Voor elk monster worden alle herhalingen van de buffer en de quencher ingelezen; de eerste vier herhalingen zullen besmet zijn door wat zich voorheen in de slang bevond. In dit geval is het signaal afkomstig van het natriumbuffer-monster dat zich mengt met water van de vorige spoeling.

Herhalingen vijf tot en met negen vertegenwoordigen het signaal van enkel het monster. Daarom sluiten we in elk geval altijd de eerste vier herhalingen uit. Om meng-artefacten te voorkomen, gaat u handmatig door de traces en verwijdert u alle foutieve herhalingen, zoals de rode trace met spikes of afwijkingen door meng-artefacten en/of luchtbellen.

Normalise vervolgens de quencher-herhalingen naar de gemiddelde startwaarde van de buffer-herhalingen voor elk monster per experimentele conditie. Combineer de gemiddelden van alle monsters in één grafiek voor visualisatie; monsters zonder gramicine zouden alle vergelijkbaar moeten zijn en bijna geen fluorescentie-quenching moeten vertonen. Er is een langzame afname van het fluorescentiesignaal vanwege de langzame instroom van thallium-ionen in de vesicles voor monsters met gramicine. Als het fluorescentieverloop zichtbaar wordt beïnvloed door de verbinding, dan wijzigt de verbinding de eigenschappen van de lipide dubbellaag bij de geteste concentratie. Fit vervolgens een gestrekte exponentiële functie op de eerste 2 tot 100 milliseconden van de genormaliseerde fluorescentie-quenchingcurves.

Voer de individuele herhalingen uit en bereken de snelheid bij twee milliseconden. Bereken vervolgens de gemiddelden en standaarddeviaties voor een gegeven monster op basis van de individuele herhalingen. Het effect van capsaïcine, hier aangeduid als cap, werd waargenomen op het tijdsverloop van fluorescentie-quenching in afwezigheid of aanwezigheid van gramine, aangeduid als ga; het genormaliseerde fluorescentiesignaal wordt hier over één seconde weergegeven. De grijze stippen vertegenwoordigen de resultaten van alle herhalingen, terwijl de rode lijnen de gemiddelden zijn.

De eerste 100 milliseconden van het genormaliseerde fluorescentiesignaal worden getoond. De grijze stippen zijn resultaten van een enkele herhaling voor elke conditie. De rode lijnen zijn stretched exponential fits van deze herhalingen.

De gestippelde blauwe lijn geeft het markeerpunt van twee milliseconden aan. Dit is het tijdstip waarop de snelheid van quenching wordt bepaald. De relatieve verandering in de quenching-snelheid wordt bepaald door de gegevens te normaliseren ten opzichte van de controlemonster met graminine en zonder modifier.

Wanneer capsaïcine wordt geabsorbeerd door de lipide dubbellaag, veranderen de eigenschappen van deze dubbellaag. De verschuiving naar een zachtere dubbellaag zal zich uiten als een verschuiving in het mono-dimeer-evenwicht in het voordeel van het geleidende dimeer. We hebben zojuist een procedure gedemonstreerd om de perturberende effecten van een klein molecuul op de dubbellaag te meten.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat er voor elk experiment de juiste controles moeten worden gebruikt met dezelfde batch vesicles. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.