Een TL-screeningstest voor het vaststellen van Modulators van GIRK kanalen
24 april 2012
Een real-time screening procedure voor het identificeren van geneesmiddelen die een interactie met G-eiwit-gated naar binnen gelijkrichter K + (GIRK) kanalen beschreven. De test maakt gebruik van membraanpotentiaal-gevoelige fluorescente kleurstoffen op GIRK activiteit op het kanaal te meten. Deze techniek is geschikt voor toepassing op een aantal cellijnen.
Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van nieuwe geneesmiddelen die grk-kanalen moduleren. Dit wordt bereikt door eerst de A TT 20-cellen in de 96-wells plaat uit te platen. De tweede stap is het verdunnen van de testverbindingen met behulp van het Verset vloeistofplaat-handlingsysteem.
Vervolgens worden de verdunde testverbindingen met de verset op de cellen aangebracht. De laatste stap is om de 96-wells plaat in de Synergy two fluorescentieplaatlezer te plaatsen en de controle- en somatostatine-oplossingen in de wells te injecteren. Uiteindelijk wordt de fluorescentieplaatlezer gebruikt om de verbindingen aan te tonen die het door somatostatine geïnduceerde fluorescentiesignaal veranderen en daarmee de Grk-kanalen moduleren.
Het voordeel van deze procedure ten opzichte van bestaande methoden, zoals patchclamp-registratie, is dat een groot aantal verbindingen snel gescreend kan worden om te bepalen of ze gerk-kanalen moduleren. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de behandeling van pijn, omdat verbindingen die het Gerk-kanaal activeren, wat leidt tot inhibitie van FI-nociceptieve transmissie, geïdentificeerd kunnen worden. De demonstratie van de procedure voor het coaten van de 96-wells platen en het uitplaten van de cellen wordt uitgevoerd door Maribel Vasquez.
Een student in mijn laboratorium start deze procedure door de pituitary A TT 20-cellen te kweken in DMEM aangevuld met 10% paarden serum bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2. Houd de cultuur in stand door de cellen elke vijf tot zeven dagen te subcultiveren met een standaard procedure. Coat vervolgens de wells van de zwarte transparante plaat.
Vul een 96-wells plaat aan de bodem met 50 µL poly-L-lysine. Laat de wells 30 minuten drogen in de incubator. Verwijder vervolgens het overtollige poly-L-lysine en zaai de cellen in de 96-wells plaat met 200 µL medium bij een dichtheid van 30.000 cellen per well.
Bewaar de cellen daarna drie tot vier dagen in de incubator. Gebruik een aspiratiesysteem om het kweekmedium langzaam uit de cellaanmaak te aspireren en was de cellen vervolgens met 200 µL normale buffersoplossing. Voeg daarna aan elk monster 200 µL buffersoplossing toe die de membraanpotentiaalgevoelige kleurstof bevat.
Incubeer de cellen gedurende 40 minuten bij 37 °C. Haal de A TT 20-cellen na 40 minuten uit de incubator, laat ze afkoelen tot kamertemperatuur en aspireer de oude buffer weg. Voeg vervolgens een verse bufferoplossing met MPD toe aan de cellen.
Gebruik vervolgens het vloeistofbehandelingssysteem om verschillende concentraties van de testverbindingen en controle-oplossingen op de cellen aan te brengen. Incubeer de cellen in de 96-wells plaat vijf minuten met de testverbindingen voorafgaand aan de fluorescentiemetingen. Plaats in deze procedure de 96-wells plaat in een biotech synergy two fluorescentieplaatlezer.
Stel het fluorescerende achtergrondsignaal vast bij een excitatiegolflengte van 520 nanometers en een emissiegolflengte van 560 nanometers. Voeg vervolgens de G PCR R-liganden of de controlesolution toe aan de wells om de GIR-kanalen te activeren met behulp van het Synergy two-injectiesysteem. Verzamel daarna de datapunten met intervallen van tien seconden over een bemonsteringsperiode van 302 seconden.
Bij de excitatie- en emissiegolflengten. Bereken de Z-factor om de betrouwbaarheid van de assay te bepalen. Z-factoren in het bereik van 0,5 tot 1,0 geven aan dat de kwaliteit van de assay uitstekend is.
Platen met Z-factoren onder 0,5 worden uitgesloten. Vanuit de analyse worden verbindingen die het fluorescentiesignaal moduleren opnieuw getest in aanwezigheid van 2 millimol bariumchloride of 500 nanomol terapine Q om de specificiteit voor inward rectifier kaliumkanalen te bevestigen; hier is een representatief HLB 0 2 1 1 15 2 fluorescentiesignaal weergegeven, gemeten over tijd in de A TT 20 cellen na toevoeging van somatostatine of een controle-oplossing. De ratio van de fluorescentie-intensiteit op de Y-as werd berekend door het signaal in aanwezigheid van somatostatine of de controle-oplossing te delen door het basissignaal gemeten vóór de toevoeging van somatostatine of de controle-oplossing.
Hier wordt de behandeling van de A TT 20-cellen met 500 nM Terapin Q getoond. Terapin Q remt de somatostatine-gemedieerde afname van het fluorescentiesignaal door zich te binden aan en de G-eiwitgekoppelde kanalen te blokkeren. En hier wordt de behandeling van de A TT 20-cellen met 20 µM propafenon getoond, wat eveneens de somatostatine-gemedieerde afname van het fluorescentiesignaal remt. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee uur worden voltooid mits correct uitgevoerd.
Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u geneesmiddelen identificeert die grk-kanalen moduleren met behulp van een fluorescerende platenlezer.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een real-time screeningsprocedure voor het identificeren van geneesmiddelen die interageren met G-proteïne-gestuurde inward rectifier K + (GIRK)-kanalen. De assay maakt gebruik van fluorescentiekleurstoffen die gevoelig zijn voor membraanpotentiaal om de GIRK-kanaalactiviteit te meten, waardoor de methode aanpasbaar is voor diverse cellijnen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Farmacologie
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- GIRK-kanalen spelen een cruciale rol in neuronale signalering.
- Het identificeren van modulatoren van GIRK-kanalen kan leiden tot nieuwe therapeutische strategieën.
- Real-time assays verhogen de efficiëntie van drugscreening.
- Fluorescerende kleurstoffen bieden een gevoelige maatstaf voor kanaalactiviteit.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een procedure voor het screenen van geneesmiddelen die GIRK-kanalen moduleren.
- Het gebruikmaken van een high-throughput formaat voor het testen van meerdere verbindingen.
- Het verbeteren van het inzicht in de farmacologie van GIRK-kanalen.
Gebruikte methoden
- Het uitplaten van TT 20-cellen in een 96-wellplaat.
- Het gebruik van het Verset-vloeistofbehandelingstysteem voor het verdunnen van testverbindingen.
- Het aanbrengen van de verdunde verbindingen op de cellen met de Verset.
- Het gebruik van een Synergy two-fluorescentieplaatlezer om de responsen te meten.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van verbindingen die somatostatine-geïnduceerde signalen beïnvloeden.
- Demonstratie van de aanpasbaarheid van de assay aan verschillende cellijnen.
- Succesvolle modulatie van de GIRK-kanaalactiviteit door de geteste verbindingen.
- Validatie van de effectiviteit van de fluorescerende plaatlezer bij screening.
Conclusies
- De ontwikkelde assay is een waardevolle tool voor het ontdekken van geneesmiddelen die zich richten op GIRK-kanalen.
- Real-time screening kan de identificatie van potentiële therapeutica versnellen.
- Verdere studies zijn nodig om de klinische implicaties van de geïdentificeerde verbindingen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Deze assay maakt high-throughput identificatie van GIRK-kanaalmodulatoren mogelijk, wat doelvalidatie in de neurowetenschappen en cardiovasculaire geneesmiddelenontwikkeling ondersteunt. Door real-time, kwantitatieve fluorescentie-uitlezingen te leveren, vermindert het de afhankelijkheid van low-throughput elektrofysiologie en versnelt het de transitie van hit naar lead. De methode vergroot het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door de effecten van verbindingen te koppelen aan functionele kanaalactiviteit in een fysiologisch relevante cellulaire context.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door functionele GIRK-kanaalmodulatie te meten in reactie op GPCR-liganden.
- Operationele waarde: Maakt snelle screening van verbindingenbibliotheken mogelijk om activatoren of remmers met mechanistische specificiteit te identificeren.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het verminderen van risico's bij targets door on-target activiteit te bevestigen via veranderingen in het fluorescentiesignaal die gecorreleerd zijn met K+ efflux.
Screening & assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Maakt gebruik van membraanpotentiaalgevoelige kleurstoffen (DiBAC4(3) of HLB 021-152) om kwantificeerbare real-time signalen te genereren bij GIRK-activatie.
- Reproduceerbaarheid: De Z-factor berekening (uitstekend bereik: 0,5–1,0) waarborgt de robuustheid van de assay voor de selectie van hits en de reproduceerbaarheid van de campagne.
- Schaalbaarheid: Compatibel met het 96-well formaat en vloeistofhandelingssystemen (bijv. Verset) voor geautomatiseerde dispensing van verbindingen en screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: De geïdentificeerde modulatoren kunnen therapeutische strategieën informeren voor neuropathische pijn, verslaving en hartritmestoornissen via GIRK-gemedieerde neuronale inhibitie.
- Translationele continuïteit: Fluorescente read-outs vormen een brug van target-engagement naar functionele output, wat de preklinische fenotype-verankering ondersteunt.
- Mechanistische risicoreductie: Specificiteit wordt bevestigd met behulp van inhibitoren zoals bariumchloride of Terapin Q om GIRK-gemedieerde effecten te onderscheiden van off-target activiteit.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie, waardoor functionele screening van GIRK-modulatoren mogelijk is vóór verdere optimalisatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door GPCR-activatie te koppelen aan GIRK-afhankelijke fluorescentieveranderingen, waardoor padmodulatie wordt verduidelijkt.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door gestandaardiseerde kleuring, toevoeging van verbindingen en kinetische fluorescentiemeting over 300 seconden.
- Analytica: Genereert kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele (fluorescentie-intensiteitsverhoudingen), waardoor vergelijking van de potentie en effectiviteit van verbindingen mogelijk wordt.
- Translationeel onderzoek: Legt een verband met preklinisch werk door verbindingen te identificeren die de neuronale exciteerbaarheid via GIRK veranderen, wat relevant is voor pijn- en verslavingsmodellen.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Platform-aanpasbaar voor diverse cellijnen en GPCR-liganden, wat hergebruik bevordert in meerdere campagnes voor target-validatie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid over targetmodulatie door mechanistische ambiguïteit bij het screenen van geneesmiddelen voor ionkanalen te verminderen.
- Operationele waarde: Biedt standaardisatie, reproduceerbaarheid en kinetische realtime-data die onbereikbaar zijn met eindpuntassays.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege functionele validatie mogelijk te maken, waardoor het risico op falen in een laat stadium door een gebrek aan target-engagement wordt verkleind.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen met bevestigde GIRK-activiteit voor verdere ontwikkeling naar lead-optimalisatie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in celkweek (AT T20-cellen), het hanteren van fluorescerende kleurstoffen en het bedienen van een kinetische platenlezer.
- Afhankelijk van een fluorescentie-platenlezer met injectiemogelijkheid (bijv. Synergy 2) en compatibele excitatie-/emissie-instellingen (520 nm/560 nm).
- Vereist standaardisatie van de kleurstofbelading, incubatietijden en buffercondities over de wells en platen heen.
- Aanpassing aan andere cellijnen vereist validatie van de GIRK-expressie en de efficiëntie van de kleurstofbelading.
- Praktische beperking: De specificiteit van de assay moet worden bevestigd met orthogonale inhibitoren (bijv. Ba2+, Terapin Q) om fluorescerende veranderingen die niet door GIRK worden gemedieerd uit te sluiten.
