Transnuclear Muizen met vooraf gedefinieerde T-cel-receptor Bijzonderheden tegen Toxoplasma gondii Verkregen via SCNT

Muizen die transgeen zijn voor antigeenspecifieke T-celreceptoren zijn onmisbaar geweest bij de studie van de ontwikkeling en functie van T-cellen om muismodellen te genereren met vooraf gedefinieerde T-celreceptor-specificiteiten met behulp van somatische celkernoverdracht of SCNT. Een muis wordt geïnfecteerd met een pathogeen van belang. T-cellen worden uit de muis geïsoleerd en vervolgens gezuiverd via fluorescentie-geactiveerde cel sortering.

De gezuiverde T-cellen worden vervolgens gebruikt voor somatische celkernoverdracht. Nadat de embryo's het blastocyste-stadium hebben bereikt, worden embryonale stamcellen geïsoleerd. Deze cellen worden vervolgens geïnjecteerd in blastocysten, die daarna worden overgebracht naar pseudodrachtige muizen.

De resulterende pups vertonen een uitgesproken toename van de T-celpopulatie van belang, wat gevalideerd kan worden via PAX-analyse. Hallo, mijn naam is Okta AK en ik ben postdoc hier bij het White Institute for Biomedical Research. Vandaag ga ik u laten zien hoe u somatische CLE-transfer blast-assist injecties uitvoert, evenals embryo-transfers.

Het belangrijkste voordeel van somatische transfer is dat er muismodellen kunnen worden gegenereerd die hun T-celreceptor tot expressie brengen vanuit de endogene locus, en dus onder controle staan van de endogene promotor, en dat deze muismodellen zeer snel kunnen worden gegenereerd. Somatische vloeistofoverdracht kan worden gebruikt als instrument om muismodellen te genereren met vooraf gedefinieerde T-celreceptor- of B-celreceptorspecificiteiten. Dit is van bijzonder belang voor onderzoekers in vakgebieden zoals autoimmuniteit, infectieziekten en kanker.

Om T-cellen te isoleren die specifiek zijn voor een pathogeen zoals Toxoplasma Gandhi, bij muizen die zijn geïnfecteerd via intraperitoneale injectie op het hoogtepunt van de immuunrespons, wordt de milt geïsoleerd uit de geëuthanaseerde muis; de gehomogeniseerde donorcellen worden vervolgens geïsoleerd en geïncubeerd met fluorescentie-gelabelde antilichamen en het juiste tetrameer. Ten slotte wordt FACS-sortering uitgevoerd om pathogeen-specifieke T-cellen te verkrijgen. De avond vóór de procedure voor oocyten-enucleatie.

Bereid piso-injectienaalden van vier, vijf en zeven micrometer voor door ze met een injectiespuit retrograad te vullen met kwik. Begin de volgende dag met het protocol voor somatische celkernoverdracht door oocyten te verzamelen en breng deze vervolgens met een mondpipet over naar druppels K-S-O-M-A-A-medium in een Petrischaal. In het deksel van de Petrischaal.

Bereid een plaat voor voor het uitvoeren van somatische celkernoverdracht of SCNT door ongeveer 10 druppels PVP, ongeveer 10 druppels HCZB met vijf microgram per milliliter cyto B en ongeveer 10 druppels HCCB met 2,5 microgram per milliliter cyto B aan te brengen. Deze plaat wordt aangeduid als de S-C-N-T-A plaat. Plaats de S-C-N-T-A plaat op de tafel van een omgekeerde samengestelde microscoop.

Plaats vervolgens een enucleatienald van 7 µm in de micromanipulator en spoel deze door vijf tot 10 keer PVP-oplossing op te zuigen en weer uit te stoten in de afvalbak. Breng daarna 10 tot 30 in metafase II gearresteerde oocyten over van de Petrischaal naar een van de druppels HCCB met 5 µg/mL Cyto B op de SCNT-plaat. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur; richt de oocyten tijdens de incubatie horizontaal uit.

Wacht vijf minuten. Gebruik de enucleatienald om een oöcyt voor de holdingnaald te plaatsen. Gebruik een micro-injector om een vacuüm aan te leggen, zodat de oöcyt aan de micropipet-holdingnaald wordt vastgezet.

Draai vervolgens de oocyten met de enucleatienald tot het chromosoomspindelcomplex, dat hypertransparant is in vergelijking met het cytoplasma, zich in de drie-uurpositie bevindt; start een piezo-puls door op het pedaal te drukken om de zona pellucida te penetreren. Een piezo-puls is een mechanische puls die longitudinaal reist en de punt van de enucleatienald doet vibreren. De vibraties van de punt helpen bij het boren door de zona pellucida.

Zodra de zona pellucida is gepenetreerd, wordt de opening van de nucleatie-naald naast de spoelfiguren van metafase II geplaatst en wordt het vacuüm aangelegd. Het chromosoom-spoelcomplex zal langzaam de naald in bewegen. Zodra de naald wordt verwijderd, moet het membraan zichzelf sluiten.

Breng ten slotte de geënucleerde cyten met een mondpipet terug in de K-S-O-M-A-A druppels. Was ze vervolgens met dezelfde pipet door ze van druppel naar druppel in KSOM AA over te brengen. Om de kernoverdracht uit te voeren, vervangt u de enucleatienald van zeven micrometer op de micromanipulator door een kernoverdrachtnaald van vier tot vijf micrometer. Was de naald zoals voorheen met PVP.

Plaats de eerder geïsoleerde CD eight positieve T-cellen in een druppel PVP op de S-C-N-D-A plaat. Meng goed en incubeer gedurende ten minste 10 minuten bij kamertemperatuur. Draag vervolgens 10 tot 30 ENUCLEATED cytes over naar een druppel HCZB met 2.5 µg/mL.

Incubeer Cyto B op de S ct. A-plaat gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Gebruik tijdens de incubatie de naald voor kernoverdracht om de cytes horizontaal uit te lijnen met behulp van de injectienaald.

Neem een donor CD8-positieve cel op uit het PVP-medium en aspireer deze herhaaldelijk totdat het buitenmembraan is afgebroken. Pas indien nodig een piezo-puls toe; fragmenten van het membraan en cytosol moeten zichtbaar worden. Zuig de nucleus op in de naald.

Ga vervolgens door met het opnemen van kernen totdat er 10 tot 30 zijn. Beweeg daarna naar de druppel met de uitgelijnde enucleerde oocyten. Pas het vacuüm toe om één oocyt aan de houdnald te fixeren.

Plaats vervolgens de NU-kernoverdrachtnaald naast de zop lucita, waarbij de kernen van de opening af zijn gericht. Pas pizo-pulsen toe totdat de naald door de zop lucita is gegaan. Bedien de micromanipulator om voorzichtig één kern naar de punt van de naald te bewegen.

Duw de naald in de oocyt totdat de punt van de naald voor twee derde is binnengedrongen. Oefen een kleine negatieve druk uit zodat een klein deel van het oocytmembraan zich in de naald bevindt. De volgende stap is zeer kritisch.

Aangezien dit het enige moment is waarop de oocyt daadwerkelijk open is, wordt er een enkele ZO-puls toegediend. Breng vervolgens een positieve druk aan om de nucleus uit de naald te duwen.

Trek de naald voorzichtig terug zodat de punt zich ongeveer op een derde van de afstand in de oocyten bevindt, breng vervolgens negatieve druk aan en blijf de naald terugtrekken om de oocyt af te sluiten. Herhaal deze stap bij elke oocyt.

Nadat alle oocyten een kern hebben ontvangen, brengt u deze over naar de Petrischaal en wast u ze door ze van druppel naar druppel over te brengen in KS OM AA-medium, geïncubeerd bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten. Na de incubatie brengt u de SCN T-embryo's over naar druppels calciumvrij activatiemedium dat strontiumchloride bevat. Strontiumchloride activeert de oocyt door de calciumoscillaties te induceren die op soortgelijke wijze tijdens de bevruchting zouden optreden.

Incubeer gedurende zes uur. Indien gewenst, voeg TSA toe, een aspecifieke remmer van histon-deacetylasen, aan het activatiemedium. Om de efficiëntie na activatie te verbeteren, worden de embryo's onder de omgekeerde microscoop onderzocht om het aantal pseudo-pronuclei of PPN-positieve SCNT-embryo's te bepalen. De PPN kunnen worden geïdentificeerd op basis van hun uiterlijk.

Ze zien eruit als eitjes. Wassen en kweken op de 'sunny side up'-methode. De embryo's worden drie en een halve dag in K-S-O-M-A-A druppels bewaard bij 37 °C totdat ze het blastocyststadium hebben bereikt.

In het begin moet u zich concentreren op het correct uitvoeren van de procedures die we zojuist hebben gedemonstreerd voor nucleatie en NU-kernoverdracht. Zodra u deze technieken beheerst, zijn de volgende procedures eenvoudiger uit te voeren. De gebruikte embryonale stamcellen (ES-cellen) zijn verkregen met behulp van standaardtechnieken.

Deze moeten worden voorbereid op de dag van de blast assisted injection, drie en een halve dag na de copulatie. Bereid het deksel van een steriele bacteriële schaal voor door druppels met PVP en HCZP aan te brengen. Bereid vervolgens, zoals voorheen, een injectienaald van 15 micrometer voor de piso-puls.

Plaats vervolgens de injectienaald in de micromanipulator en was deze met PVP-transfer. Voer 10 tot 30 blast-assists uit in een druppel HCZB. Plaats daarna 5 tot 50 µL van de ESL-suspensie in een andere druppel HCZB.

Er moeten voldoende ES-cellen aanwezig zijn zodat ze gemakkelijk kunnen worden opgenomen, maar ze mogen niet te dicht op elkaar zitten. Neem vervolgens 30 tot 100 ES-cellen op met de injectienaald. Verplaats deze naar de druppel met de blast assist.

Lijn de blast assist horizontaal uit en fixeer deze met de houdaald door vacuüm aan te leggen. Gebruik de injectienaald om de blast assist te draaien totdat de inner cell mass zich op negen uur bevindt. Plaats de injectienaald op drie uur.

Zorg ervoor dat er geen ES-cellen aan de punt van de naald zitten en breng een piezo-puls toe totdat de injectienaald door de zona pellucida en de trifecta in de blastoceel dringt. Laat vijf tot 15 ES-cellen vrij, zodat deze aan de binnenste celmassa hechten. Ga door tot alle blastoceleten zijn geïnjecteerd nadat de injecties zijn voltooid.

Was twee keer met K-S-O-M-A-A en ga over tot chirurgische embryo-transfer naar pseudodrachtige vrouwtjes; plaats een geanestheseerde pseudodrachtige ontvanger-muis in het operatiegebied. Verwijder met een elektrisch scheerapparaat het haar van het rechteronderkwadrant. Desinfecteer het gebied onder een dissectiemicroscoop met een op jodium gebaseerde oplossing en 70% ethanol.

Gebruik een schaar om de huid te openen, plaats vervolgens een gesloten schaar tussen de huid en het peritoneum en open deze om het peritoneum van de huid te scheiden. Lokaliseer de eierstok door het peritoneum heen, welke zichtbaar zou moeten zijn als een rode vlek. Gebruik vervolgens een schaar om het peritoneum in dat gebied te openen.

Gebruik een pincet om de UCT of het omringende vet voorzichtig vast te pakken en trek de uterus eruit met behulp van een capillair dat is verbonden met een mondpipet. Neem een groep van ongeveer 10 blastocyste-assistenten op terwijl u de eileider en de uterus met een pincet vasthoudt. Gebruik een naald om een klein gaatje in de uterus te prikken.

Voer vervolgens de capillair met de blast-assist in het lumen van de uterus in en laat deze los. Duw de uterus terug in de buikholte. Lokaliseer de randen van het peritoneum en sluit dit met enkele hechtingen.

Sluit de huid van de muis met enkele nietjes. Dien subcutaan pijnstillende medicatie toe. Plaats de muis vervolgens terug in de kooi onder een warmtelamp.

Blijf de ademhaling van de muis bewaken tot deze wakker wordt. Na de enucleatie en somatische celkernoverdracht waren ongeveer 70% van de embryo's positief voor pseudo-pronuclei.

Zoals weergegeven in deze figuur. Behandeling met TSA gedurende respectievelijk zes of 10 uur had geen effect. Na drie en een halve dag in cultuur ontwikkelden vijf tot 10% van de embryo's zich tot blastocysten.

Opnieuw had de toevoeging van TSA geen effect op de snelheid van de blastocyst-ontwikkeling. De SCNT-blastocysten werden vervolgens gebruikt voor het afleiden van embryonale stamcellen. TSA verbeterde de snelheid waarmee ESL werden afgeleid uit blastocysten aanzienlijk.

De S-C-N-T-E-S-cellen worden gebruikt om chimere muizen te genereren. Er wordt bloed afgenomen van deze muizen en geanalyseerd op de aanwezigheid van specifieke T-cellen met behulp van FACS-analyse, zoals hier wordt getoond. Wanneer bloed wordt gekleurd met anti-CD4-antilichaam en een specifiek tetrameer, kan een dubbelpositieve populatie worden geïdentificeerd.

Dit geeft aan dat de donorcel die voor SCNT werd gebruikt, de juiste specificiteit had. Ik heb u zojuist laten zien hoe u somatische cel LU-transfer, blast-assist injecties en embryotransfer uitvoert. Het belangrijkste aandachtspunt is de zuiverheid van uw T-cellen of B-cellen.

Zodra u heeft geleerd hoe u somatische transfer uitvoert en uw embryo's het blastocyststadium hebben bereikt, kunt u kiezen tussen het direct terugplaatsen ervan in pseudodrachtige vrouwtjes of het gebruiken ervan voor het afleiden van embryonale stamcellen en het genereren van chimere muizen.