Evaluatie van de ruimtelijke verdeling van γH2AX volgende ioniserende straling
7 augustus 2010
Microscopische analyse van γH2AX foei, welke vorm na de fosforylatie van H2AX op Ser-139 in reactie op DNA dubbelstrengs breuken, is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in straling biologie. Hier hebben we gebruik gemaakt van een antilichaam aan mono-gemethyleerde histon H3 op lysine 4 als een epigenetische marker van actief transcriberen euchromatin, om de ruimtelijke verdeling van de straling-geïnduceerde γH2AX formatie binnen de kern te evalueren.
Hallo, ik ben Raja Ti en ik promoveer aan het Baker IDI Heart and Diabetes Institute. Ik zal u door de stappen leiden die betrokken zijn bij de 3D-illustratie van epigenetische modificaties die DNA-schade en chromatinecondensatie in een nieuwe hartcel markeren. DNA is gewikkeld rond nucleosomen.
Elk nucleosoom bestaat uit vier verschillende typen histonen: H2A, H2B, H3 en H4. De vorming van DNA-breuken wordt gemarkeerd door fosforylering van H2AX. Deze fosforylering van H2AX vindt voornamelijk plaats in chromatine dat is gemarkeerd door methylering van H3K4. We bekijken nu de 3D-illustratie van modificaties in een cel met immunolabeling voor gefosforyleerd H2AX en gemethyleerd H3K4.
Laten we beginnen. We starten door een hoeveelheid van de cel-suspensie in 15 ml Falcon-buizen te plaatsen. Deze worden twee keer gewassen met PBS door centrifugatie bij 50 g en vervolgens opnieuw geresuspendeerd.
Resuspendeer in vers medium om het onmiddellijke effect van straling op cellulaire processen te observeren. Houd de cellen vijf tot 10 minuten voor en tijdens de bestraling op de ogen. Stel de cellen bloot aan gamma-straling of röntgenstraling. Dispenseer na bestraling drie milliliters van de celsuspensie in elk van de zes GU's.
Wellplaat voor piek gamma H2AX; incubeer de cellen tussen 30 minuten en één uur bij 37 °C. We gebruiken de Cytospin voor het plaatsen van de niet-adherente cellen op glasplaatjes. Let bij het monteren van de Cytospin-clip erop dat de gehele filterkarton samenvalt met de trechter.
Breng 50 µL van deze cel-suspensie aan op elk cytospin-filter, plaats de cytospin-filters in de centrifuge en centrifugeer 5 minuten bij 500 RPM. Verwijder de cytospin-filters en scheid de objectglazen van de filterkaart. Laat de cellen niet te lang aan de lucht drogen, aangezien dit de achtergrond bij de fluoresceïne-kleuring kan beïnvloeden.
Met behulp van vloeistofblokkerende pennen trekken we cirkels rond elke uitstrijk. Vervolgens fixeren we de cellen met 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. In vergelijking met ethanol of methanol werd een betere fixatie waargenomen met 4% paraformaldehyde. De slides worden gewassen met PBS en de cellen worden gepermeabiliseerd met Triton X 100 bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.
Vergeleken met twin 80 observeerden we een beter signaal in cellen met Triton X 100. Bekijk de cellen drie keer met PP S3 gedurende vijf minuten per keer. Blokkeer de cellen in één procent BSA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en herhaal dit drie keer in vergelijking met andere blokkeringsmiddelen en tijden.
BSA was het meest effectief in het minimaliseren van aspecifieke binding van primaire antilichamen; we hebben twee primaire antilichamen gebruikt, verdund 1 op 500 met 1% BSA, met ongeveer 50 µL primair antilichaam per objectglas. Incubatie van het primaire antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten vermindert de achtergrondkleuring in vergelijking met een incubatie gedurende de nacht bij 4 °C. Was de cellen drie keer met PBS gedurende vijf minuten.
Alexa floor 4 88, goede anti-muis en Alexa floor 5 46 word anti-konijn. Secundaire antilichamen werden gebruikt om verschillende markers gelijktijdig te labelen. Gebruik antilichamen die zijn geproduceerd in verschillende diersoorten.
Voeg ongeveer 50 µL van het verdunde secundaire antilichaam toe aan elk objectglas. Incubeer de cellen gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur. Het wordt aanbevolen om de cellen in een vochtige kamer te incuberen om te voorkomen dat de cellen en het antilichaam uitdrogen. Was de objectglazen 3 keer gedurende vijf minuten met PBS.
50 µL van een 1:500 verdunning van topo drie in PBS werd aan elke slide toegevoegd. Was de slides drie keer met PBS, telkens gedurende vijf minuten. Verwijder overtollig vocht van de slides en voeg de Antifa-oplossing toe.
Het wordt aanbevolen om de cellen niet volledig te laten uitdrogen voordat de Antifa-oplossing wordt toegevoegd. Plaats een dekglas op het preparaatglas. Er moet zorg worden betracht om de vorming van luchtbellen te voorkomen.
Laat de preparaten een nacht in een donkere, vochtige kamer liggen. Seal het preparaat met nagellak om uitdroging van de cellen te voorkomen. Beelden verkregen met een confocale microscoop tonen.
Voor een betere ruimtelijke resolutie werd een heliumlaser gebruikt voor de beeldacquisitie. Voor de objectieven werd gekozen voor 63x olie-immersie lenzen in plaats van lenzen met een hogere of lagere vergroting. Een zoomfactor van drie of vier zal een beeld met een betere resolutie opleveren.
Voor FO-accounting van veel cellen is het bij voorkeur gebruik te maken van een scansnelheid van acht en een beeldformaat van 1024 bij 1024 pixels per cel. Bij beeldvorming voor meerdere kanalen wordt een sequentiële line-scan acquisitie aanbevolen ten opzichte van een frame-scan. Om bleking van het specimen te voorkomen, worden de detectorversterking (gain) en de amplifier offset aangepast om ruis en signaalverzadiging te verminderen.
Aangezien de grootte van Kama HX X four kleiner kan zijn dan 0,5 micrometer, wordt aangeraden om beelden te verkrijgen met een resolutie van ten minste 0,5 micrometer. Beelden met een stapgrootte langs de jet-as zijn vereist in een jet-seriepatroon met gebruik van het 'mark first' en 'mark lost' patroon. Om de ruimtelijke relatie tussen verschillende eiwitten te illustreren, wordt aangeraden om een scansnelheid van zes te gebruiken met een beeldgrootte van 2048 en 248 pixels middels metamor first.
Ten tweede kan er worden geteld vanaf beelden die zijn verkregen met diverse confocale microscopen. Open de gamma hgx-afbeeldingsbestanden ofwel direct via het bestandsmenu of door gebruik te maken van de referentienummers. Ga naar het procesmenu en kies Stack arithmatic.
Kies maximum projectie en selecteer de vlakken die moeten worden opgenomen. Klik vervolgens op oké. Kies nu top hat en selecteer het Gamma H twee X-beeld als bronbeeld en pas dit toe.
Het top hat-filter en de resulterende afbeelding zullen een binaire afbeelding zijn met minder ruis en een verminderde variatie in de intensiteit van de brandpunten. Ga naar regio's, selecteer de tool voor het tekenen van regio's en teken regio's rond de kernen. Ga naar het procesmenu en selecteer drempelwaarde afbeelding.
Kies de inclusiedrempel en stel de lagere en hogere drempelwaarden in. Meestal zijn het de drempelwaarden die de vier getallen beïnvloeden. De optimale drempelwaarde is degene die de inclusie van de achtergrond minimaliseert en de inclusie van de foray maximaliseert.
Dit kan het beste worden bereikt door het aantal forays te tellen met behulp van verschillende drempelwaarden. Vergelijk vervolgens het aantal forays met de telling met het blote oog. Selecteer de DPI-afbeelding, ga naar het menu regio's en selecteer de optie regio's overdragen.
Nu hebben we de overeenkomstige foray- en kernbeelden gereed voor het tellen. De meeste kernregio's zijn overgebracht naar top hat. Ga naar het menu 'Measure' en selecteer 'integrated ary analysis' of 'IMA'. Selecteer 'Measure all regions' en klik op 'measure' om het FTE-aantal te verkrijgen.
Nu kunnen de FTE-getallen van elke regio naar een spreadsheet worden geëxporteerd via de optie 'Log data'. Open de eerder gemaakte jet-projectorafbeeldingen voor elk kanaal. Ga naar 'display' en selecteer 'color align'.
Selecteer de respectievelijke bronafbeeldingen voor elk kanaal om een samengestelde afbeelding voor alle drie de kanalen te maken. Er wordt een line scan-analyse uitgevoerd om de ruimtelijke positionering van verschillende markers in de kern te illustreren. Ga naar het commando in de meetwerkbalken en selecteer line scan-analyse en trek een lijn over de cel.
Hiermee wordt een grafiek gemaakt die de fluorescentie-intensiteit van elk kanaal langs de lijn toont en de afstand tussen de verschillende markers ten opzichte van elkaar weergeeft. Om een 3D-beeld uit een stack te maken, gaat u naar het stack-menu en kiest u 3D reconstruction. Selecteer als type 3D-reconstructie maximum.
Kies het rotatieplan en kies de kalibratieafstand van de jet. Gewoonlijk specificeert de gebruiker dit en klikt vervolgens op oké om een 3D-reconstructie te maken. Hiermee is ons protocol voor immunofluorescentiekleuring en beeldanalyse voltooid.
Samenvattend is confocale immunofluorescentiemicroscopie een techniek voor de driedimensionale visualisatie van verschillende C-markers en gamma H2AX-foci in de celkern. Bedankt voor het kijken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op de analyse van γH2AX-foci, die kritische indicatoren zijn voor DNA-dubbelstrengsbreuken in de stralingsbiologie. Door gebruik te maken van een antilichaam tegen mono-gemethyleerd histon H3 op lysine 4, evalueert het onderzoek de ruimtelijke distributie van γH2AX-vorming binnen de kernus na blootstelling aan straling.
Belangrijke onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Stralingsbiologie
- DNA-schaderespons
- Epigenetica
Achtergrond
- De vorming van γH2AX-foci is een reactie op DNA-schade.
- Fosforylering van H2AX op Ser-139 is een belangrijke marker.
- Mono-methylering van histon H3 op lysine 4 duidt op actieve transcriptie.
- Inzicht in de ruimtelijke distributie van DNA-schade is essentieel voor stralingsonderzoeken.
Doel van de studie
- Om de vorming van γH2AX-foci als reactie op straling te analyseren.
- Om de rol van epigenetische markers bij de DNA-schaderespons te beoordelen.
- Om de ruimtelijke distributie van deze markers binnen de nucleus te visualiseren.
Gebruikte methoden
- Microscopische analyse van γH2AX-foci.
- Gebruik van antilichamen voor het detecteren van mono-gemethyleerd histon H3.
- 3D-illustratietechnieken voor het visualiseren van nucleaire modificaties.
- Evaluatie van stralingsgeïnduceerde effecten op de chromatine-structuur.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van γH2AX-foci als markers voor dubbelstrengs DNA-breuken.
- Demonstratie van de ruimtelijke distributie van deze foci in de nucleus.
- Correlatie tussen histonmodificaties en transcriptionele activiteit.
- Inzichten in het epigenetische landschap na blootstelling aan straling.
Conclusies
- γH2AX foci dienen als effectieve indicatoren voor DNA-schade.
- Histonmodificaties verschaft waardevolle informatie over de staat van het chromatine.
- De studie vergroot het begrip van de cellulaire respons op straling.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het begrijpen van de ruimtelijke distributie van DNA-schademarkers zoals γH2AX biedt mechanistische inzichten in de chromatinestructuur en transcriptionele activiteit na blootstelling aan straling. Deze benadering ondersteunt targetvalidatie door epigenetische toestanden te koppelen aan DNA-reparatiepaden, wat voorspellend vertrouwen mogelijk maakt in preklinische modellen van genotoxische stress. De methode verbetert de assay-ontwikkeling voor het screenen van stralingsmodificerende verbindingen door de vorming van foci in gedefinieerde nucleaire compartimenten te kwantificeren.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door γH2AX-foci te correleren met actief euchromatine dat is gemarkeerd door H3K4-methylering.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk door middel van ruimtelijke resolutie van DNA-schade in transcriptioneel relevante chromatinegebieden.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage door verbindingen te identificeren die chromatine-afhankelijke DNA-schaderesponsen beïnvloeden.
Screening & assay-ontwikkeling
- Assay-gereedheid: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-screening door de detectie van foci en co-lokalisatie met epigenetische markers te standaardiseren.
- Kwantitatieve output: Levert reproduceerbare, op beeldvorming gebaseerde read-outs van de vorming van γH2AX-foci en de ruimtelijke distributie in niet-adherente cellen.
- Relevantie voor screening: Ondersteunt betrouwbare evaluatie van verbindingen door high-content-analyse van DNA-schade in chromatin-gecontextualiseerde systemen mogelijk te maken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt vroege signalering van DNA-schade met preklinische validatie via uitlijning van biomarkers specifiek voor de chromatinestatus.
- Mechanische risicoreductie: Richt zich op de voorspellende waarde door te verduidelijken hoe transcriptionele activiteit de verspreiding van γH2AX na bestraling beïnvloedt.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Informeert go/no-go-beslissingen door verschillen in schadeherstel tussen euchromatine en heterochromatine bloot te leggen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische beoordeling, in het bijzonder voor het screenen van genotoxische verbindingen en mechanistische follow-up.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door ruimtelijke patronen van DNA-schade in relatie tot transcriptionele activiteit te onthullen.
- Screening: Verbetert de reproduceerbaarheid van assays en de kwantitatieve meting van foci voor de evaluatie van het effect van verbindingen.
- Analytics: Biedt geïntegreerde gegevens over intensiteit en ruimtelijke distributie, waardoor een vergelijkende analyse van condities mogelijk is.
- Translational Research: Verbindt preklinische continuïteit via de afstemming van epigenetische biomarkers in stralingsresponomodellen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar imaging- en analyseplatform voor studies naar DNA-schade binnen de context van chromatine.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door mechanistische ambiguïteit bij de lokalisatie van DNA-schade te verminderen.
- Operationele waarde: Zorgt voor standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid bij de kwantificering van foci en co-lokalisatieanalyse.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie, en vermindert biologische risico's in een laat stadium binnen genotoxicologieprogramma's.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk op basis van chromatine-afhankelijke DNA-schade en herstelphenotypen.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in immunofluorescentie, confocale microscopie en de detectie van epigenetische markers.
- Afhankelijk van instrumentatie voor 3D-reconstructie, line-scan analyse en drempelwaarde-gebaseerde beeldverwerking.
- Necessiteert standaardisatie tussen teams voor antilichaamvalidatie, beeldparameters en protocollen voor het tellen van foci.
- Houdt rekening met aanpassingen voor verschillende celtypen, in het bijzonder niet-adherente en primaire celmodellen.
- Praktische beperkingen omvatten de signaalresolutie voor submicrometer-foci en potentieel bleaching tijdens multi-channel acquisitie.
