Het uitvoeren van op maat MicroRNA microarray experimenten

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van een micro-RNA microarray-experiment. Dit wordt bereikt door eerst geprinte microarray-dia's te verkrijgen die een bibliotheek van micro-RNA-sondes bevatten en RNA-monsters met een geschikte kwaliteit en hoeveelheid voor te bereiden. Vervolgens worden het RNA en een gecontroleerd DNA-monster gelabeld met fluorescerende kleurstoffen.

Vervolgens worden de gelabelde nucleïnezuren toegevoegd aan een microarray-dia voor hybridisatie. Ten slotte wordt de microarray-dia gewassen en gescand, waarna de dia wordt geregenereerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de genoombrede expressie van microRNA's tonen door analyse van de dia op hybridisatie-intensiteiten van de individuele microRNA-probes.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van genexpressie, zoals de manier waarop normale fysiologische omstandigheden of pathologische omstandigheden de expressie van micro-RNA's op globale schaal differentieel beïnvloeden. De kwaliteit van de fabricage van de microarray is een van de meest kritische factoren voor het succes van een microarray-experiment. Nadat het RNA is geïsoleerd met een methode die kleine RNA's behoudt en is geresuspendeerd in een concentratie van twee milligram per milliliter of hoger, wordt het RNA gelabeld in een reactievolume van 20 µL door eerst ongeveer 25 µg totaal RNA te mengen met 0,5 µg 5' P-C-U-D-Y 5 4 7 3' in één X HEPs-buffer aangevuld met T4 RNA Ligase 1D TT en ATP. Indien er minder RNA beschikbaar is, dient de hoeveelheid RNA en de reactie proportioneel te worden geschaald.

Als het RNA zeer verdund is, voeg dan een drager toe zoals gist-tRNA om de precipitatie te bevorderen en incubeer de reactie op ijs in een koelkast gedurende 2 tot 24 uur. Voeg vervolgens natriumacetaat toe tot 0,3 M, gevolgd door drie volumes ethanol, en precipiteer het RNA gedurende de nacht bij -20 °C. Om de slides voor de eerste keer te gebruiken, moeten deze worden geprehybridiseerd in een gefiltreerde oplossing van 3 XSSC, 0,1% SDS en 0,2% BSA gedurende 30 tot 60 minuten bij 37 °C.

Dompel de objectglazen vervolgens een paar keer onder in water. Dompel ze daarna onder in isopropanol en droog de objectglazen met een centrifuge voorzien van een objectglashouder bij 100 ×g gedurende vijf minuten bij 22 °C. Spoel de liftstrips af in water.

Plaats vervolgens in ethanol, vóór het luchtdrogen, een objectglas in de basis van een microarray-hybridisatiekamer en een dekglas bovenop het objectglas, zodanig dat het dekglas het probegebied en de witte strepen bedekt. Behandel het objectglas in het donker, centrifugeer het neergeslagen gelabelde RNA, was dit eenmaal met 70% ethanol en laat de pellet aan de lucht drogen. De pellet moet roodachtig van kleur zijn.

Bereid een hybridisatielosie voor met een volume van 1/15 tot 1/100 van het gezuiverde gelabelde referentie-DNA per RNA-monster. Los het RNA-pellet volledig op met ongeveer 60 µL van de hybridisatieoplossing om te voorkomen dat de hybridisatieoplossing uitdroogt. Voeg tijdens de incubatie 20 µL water toe aan elk van de bevochtigingsputjes in de basis van de microarray-hybridisatiekamer.

Voeg het mengsel van gelabeld RNA en referentie-DNA toe aan de objectglasplaat. Raak met een dunne pipetpunt voorzichtig de rand van het dekglas aan en gebruik zuigkracht om de oplossing de ruimte tussen het dekglas en de objectglasplaat te laten binnendringen.

Plaats de afdekking van de hybridisatiekamer op de basis. Sluit de kamer vervolgens af met metalen klemmen. Plaats de gehele kamer in de plastic zak die bij de kamercassette wordt geleverd.

Plaats tot slot de kamercassette in een houder met een nat vel papier. Dek de houder vervolgens af met vershoudfolie en plaats deze gedurende ongeveer 24 uur in een bevochtigde celkweekincubator bij 37 °C. Om de coupes na hybridisatie te verwerken, worden de kamercassettes één voor één gedemonteerd en wordt elke coupe samen met het bijbehorende dekglasje ondergedompeld in 2X SSC bij 22 °C.

Het liftplaatje zal vanzelf van de objectglasafglijden; was de objectglazen twee keer in 0,8 XSSC en vervolgens drie keer in 0,4 XSSC gedurende een totale tijd van één tot twee minuten. Droog de objectglazen met een centrifuge die is voorzien van een objectglasadapter. Scan daarna de objectglazen met een microarray-scanner en gebruik een programma zoals BlueFuse om de intensiteiten in de afbeeldingsbestanden te kwantificeren.

Inspecteer de individuele spots om abnormale spots uit te sluiten die gewoonlijk ontstaan door het printen van de pore-slide of door de hantering van de slide na hybridisatie. Gebruik voor data-analyse en presentatie programma's zoals gene springing en excel om de microarray opnieuw te gebruiken. Strip de slide door deze te spoelen met water en vervolgens 10 tot 20 minuten onder te dompelen in een kleurplaat met voorverwarmde 1 millimolar NAOH en 0.1 XSSC bij 62 degrees Celsius.

Herhaal de incubatie een tweede keer. Was de objectglazen meerdere keren in water gedurende maximaal 60 minuten met voorzichtig schudden bij 22 °C. Droog de objectglazen met behulp van een centrifuge en bewaar ze bij 22 °C.

De objectglaasjes kunnen zonder voorafgaande hybridisatie worden gebruikt. Deze figuur toont een gescande afbeelding van een microarray die zeer nauwkeurige en sterke hybridisatiesignalen laat zien. Rode spots resulted uit hybridisatie van het referentie-DNA, groene spots uit het met DY 5 47 gelabelde RNA-monster, en de gele spots waren afkomstig van hybridisatie van zowel het DNA als het RNA aan dezelfde probes.

De Pearson-correlatiecoëfficiënten tussen technische replica's van microarray-hybridisatie bedragen ongeveer 0,99, wat wijst op een uitstekende reproduceerbaarheid. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in het uitvoeren van een aangepast microarray-experiment, niet alleen voor het kwantificeren van micronase, maar ook voor het kwantificeren van andere typen nucleïnezuren, zoals mRNA's.