Combinatie van Adhesive-tape-gebaseerde Sampling en fluorescentie In situ Hybridisatie voor snelle detectie van Salmonella Op Fresh Produce

Het algemene doel van deze procedure is om bemonstering van verse produce met behulp van plakband te koppelen aan moleculaire detectie van salmonella-soorten in hele cellen middels rapid fluorescence in situ hybridization, ook wel bekend als FISH. Dit wordt bereikt door eerst plakband aan te brengen op het gewenste materiaal en oppervlaktegebonden cellen te extraheren. Tapes met celladen kunnen direct worden geanalyseerd of worden onderworpen aan verrijking in vaste of vloeibare fase.

De tweede stap van de procedure bestaat uit fixatie op de tape en dehydratie in een ethanolserie voor cellen die zijn geïnoculeerd in of verrijkt in bouillon. De tweede stap omvat cellenfixatie in suspensie, gevolgd door resuspensie van de cellen in opslagbuffer. De derde stap van de procedure is het uitvoeren van een snelle hybridisatiestap op de tape met gebruik van een salmonella-specifieke oligonucleotide-sondecocktail, gevolgd door het verwijderen van overtollige sonde met een spoeling met wasbuffer; voor monsters die via FISH worden geanalyseerd, wordt de FISH-stap in suspensie uitgevoerd en kan overtollige sonde worden verwijderd middels een eenvoudige verdunningsstap voorafgaand aan de analyse.

De laatste stap van de procedure is het tegenkleuren van de gehybridiseerde tape-bound cellen met DPI en het onderzoeken ervan met fluorescentiemicroscopie. Voor analyses op basis van feiten is een tegenkleuring niet nodig. Uiteindelijk biedt deze methode een manier voor visuele of cytometrische detectie van salmonellasoorten die aanwezig kunnen zijn op bemonsterde verse produce.

Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode toen ik las over een Italiaanse groep die een vergelijkbare aanpak gebruikte om bacteriële gemeenschappen op Romeinse aero-steenrelikwieën te onderzoeken. Vervolgens hebben r en ik een discussie over dit werk gevoerd in een vak dat ik gaf over snelle methoden in de voedingsmiddelenmicrobiologie. Een paar weken later begon een salmonella-uitbraak, die werd teruggevoerd op verse producten, die uiteindelijk bijna 1500 mensen in 43 verschillende staten ziek maakte.

Hoewel onze experimentele aanpak een actuele en praktische weg biedt voor de detectie van specifieke bacteriële typen op verse producten, is deze ook draagbaar genoeg om testen in het veld of in een voedselproductieomgeving mogelijk te maken. Begin met het selecteren van een tape voor de bemonstering. Enkele opties zijn de commercieel verkrijgbare schimmeltape of contactplates, die steriel zijn en verpakt zijn voor gebruiksgemak.

Teken met een permanente marker vierkantjes van één centimeter op de niet-plakkerige zijde van een stuk plakband van 10 centimeter, gebruik hiervoor een steriele aluminium mal. Dit dient als visuele gids om aan te geven welk deel van het plakband is gebruikt om het voedsel of het omgevingsoppervlak te bemonsteren. Vorm een C-vormige lus van het plakband met de plakkerige zijde naar het te bemonsteren oppervlak. Doe dit door de plakkerige uiteinden met de duim en middelvinger vast te houden en de wijsvinger tegen het getekende vierkant op de achterzijde van het plakband te plaatsen.

Plaats de tape op het te bemonsteren oppervlak en druk het gemarkeerde gebied voorzichtig tegen het oppervlak aan, zonder de randen van de tape los te laten. Gebruik de wijsvinger om ervoor te zorgen dat de plakzijde van de tape volledig in contact komt met het monsteroppervlak. Vermijd luchtbellen door een gelijkmatige beweging te maken.

Trek de tape langzaam van het monster af. Door oppervlaktegebonden microben fysiek te extraheren, wordt de celconcentratie vastgelegd. Plak de tape met de plakzijde naar boven op een glazen microscoopglaasje. Gebruik hiervoor gewone transparante kantoortape en zorg voor de juiste spanning en rek van de tape, zodat er een vlak, rimpelvrij oppervlak ontstaat.

Dit helpt om problemen met vervorming of kromtrekken van de tape te minimaliseren tijdens het daaropvolgende verhitten. Plaats de tape tijdens de hybridisatie met de zijde naar beneden op xylose slicing tertile four of XLT four agri-platen, zodat de bemonsterde cellen in direct contact zijn met het agri-oppervlak om het eenvoudig verwijderen van de tape van het agri-oppervlak te vergemakkelijken.

Na verrijking wordt het gedeelte van de tape met het sjabloon van het monster strak tegen het agar-oppervlak geplaatst en wordt één uiteinde van de tape losjes vastgeplakt. De wanden van de Petri-schaaltjes worden omgekeerd om condensatie te voorkomen en geïncubeerd bij 35 °C. Om voldoende groei van salmonellasoorten mogelijk te maken, hangt de benodigde lengte van de incubatieperiode om de cellen tot een detecteerbaar niveau te verrijken af van de initiële salmonellabesmettingsniveaus.

Open na de gewenste verrijkingsperiode de agarplaat; de tape behoudt zijn kleefkracht tijdens de incubatie. Druk de tape voorzichtig met de wijsvinger tegen de agar om een maximale terugwinning van microkolonies te garanderen die zich op de interface tussen de tape en de agar hebben gevormd. Pak de tape vast bij de rand die aan de wand van de Petrischaal is bevestigd en verwijder deze met een langzame, gelijkmatige beweging. Bevestig de tape met de celladen met behulp van gewone transparante kantoortape met de plakzijde naar boven op een microscoopglas, zodat een vlak, kreukvrij oppervlak ontstaat.

Voer de fixatie van de cellen op de tape uit gedurende 30 minuten bij 25 °C door het contactoppervlak van het monster te bedekken met 500 µL 10% neutraal gebufferde formaline. Gooi het fixeer middel in een afsluitbare container onder een chemische afzuigkap om blootstelling aan irriterende of toxische dampen te minimaliseren, was de tape eenmaal in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS door het tape-oppervlak voorzichtig te overspoelen met PBS en dehydrateer het monster. Bereid met behulp van een progressieve ethanolserie pre-hybridisatie-, hybridisatie- en wasbuffers met behulp van commerciële oplossingen van moleculaire biologie-kwaliteit, filter deze met een 0,22 µm spuitfilter en verwarm de hybridisatie- en wasbuffers voor tot 55 °C.

Voeg fluorescentie-gelabelde oligonucleotide-sondes toe aan voorverwarmde hybridisatiebuffer voor een uiteindelijke sondeconcentratie van 5 ng/µL. Bedek het contactoppervlak van de tape met het template-monster met 300 µL hybridisatiebuffer die de sondecocktail bevat. Incubeer de gehybridiseerde tape-gebonden cellen in een vochtige, afgesloten incubatiekamer op 55 °C, gebruikmakend van een direct-contact-incubator, zoals een instrument in slide-modus, gedurende 15 minuten. Verwijder na hybridisatie de slides en gooi de overlay van de hybridisatiebuffer met de sonde weg. Spoel kort en voorzichtig door middel van pipetteren met voorverwarmde wasbuffer.

Een klein volume buffer over een gekanteld objectglas zorgt ervoor dat de glazen aan de lucht kunnen drogen voor de onap-detectie van salmonellasoorten via fluorescentiemicroscopie. Bedek het objectglas met ongeveer 10 µL Vector Shield H 1200, een montage medium dat dpi bevat, de nucleaire tegenkleuring, en incubeer dit 10 minuten in het donker. Breng immersieolie aan op het dekglas en onderzoek de monsters met een olie-objectief met hoge vergroting.

Het DPI-filter wordt gebruikt om het monster scherp te stellen. De microscoop wordt vervolgens overgeschakeld naar het juiste filter, waarna de salmonella-cellen visueel worden gescoord op basis van hun groene of rode fluorescentie, afhankelijk van welke kleurstof is gebruikt om de probes te labelen. Voor detectie via flowcytometrie worden monsters gesuspendeerd in PBS overgebracht naar ronde bemonsteringsbuisjes van 5 ml en geanalyseerd met een flowcytometer met excitatie bij 647 nanometers.

Analyseer de gegevens met FlowJo-software. Bemonstering met plakband van terica serovar, Ty Murium vanaf het oppervlak van een kunstmatig besmette tomaat, vergemakkelijkt directe analyse na de visgang via microscopie of celbelading via flowcytometrie. De tapes werden verwerkt voor snelle fluorescentie in C twee hybridisatie met behulp van een combinatie van salmonella-specifieke DNA-probes en gelabeld met Texas Red, afhankelijk van de initiële lokale concentratie van salmonella-cellen op de tape.

Verrijking in de vaste fase leverde resultaten op variërend van geïsoleerde microkolonies tot confluente groei. Met tape bemonsterde cellen konden worden geanalyseerd via een combinatie van FISH en flowcytometrie, ofwel direct na bemonstering of na een vloeibare oppervlaktefase van vijf uur. Verrijking in miniculturen bij 35 °C.

Hoewel we het gebruik van de tape-fish techniek voor voedselveiligheid hebben beschreven, heeft de methode ook een groot potentieel voor gebruik in andere disciplines, waaronder de milieumicrobiologie, plantenpathologie of klinische microbiologie. Parallel aan deze procedure kunnen aanvullende experimenten, zoals biochemische tests of PCR, worden uitgevoerd op verrijkingen in vaste of vloeibare fase vanuit de met tape geëxtraheerde monsters. Deze tests kunnen worden gebruikt om vragen te beantwoorden over een eventueel aanwezige salmonella, vragen die buiten het bereik van de fish-procedure vallen.