Analyse van de mRNA Nuclear Export Kinetics in zoogdiercellen door micro-injectie

Het algemene doel van deze procedure is het meten van de kinetiek van de nucleaire export van mRNA in zoogdiercellen. Dit wordt bereikt door eerst mRNA of DNA in de kernen van weefselkweekcellen van zoogdieren te micro-injecteren. Na de micro-injectie worden de monsters gefixeerd na verschillende incubatieperioden.

Het mRNA wordt vervolgens gekleurd via fluorescentie in situ hybridisatie of FISH. De laatste stap van de procedure is het afbeelden van de cellen en het kwantificeren van de hoeveelheid fluorescentie in het cytoplasma en de nucleus. Uiteindelijk kan de snelheid van mRNA-export worden gemeten door middel van een combinatie van microinjectie en fluorescentiemicroscopie.

Hoi, ik ben SRG AV van het laboratorium van Alex Palazzo van de afdeling Biochemie aan de Universiteit van Toronto. Ik ben Stefan Toski, ook van het Palazzo Lab. Ik ben Amy van het Palazzo lab en ik ben Khi Maha David van het Palazzo lab.

Vandaag tonen we u een procedure voor het introduceren van mRNA in de kernen van mammale weefselkulturcellen door middel van micro-injectie. We zullen ook demonstreren hoe het mRNA kan worden gekleurd met fluorescentie in situ hybridisatie. We gebruiken deze procedures in ons laboratorium om de kinetiek van de nucleaire export van mRNA in mammale cellen te bestuderen.

Laten we beginnen. Dilueer vóór de micro-injectie vooraf geprepareerd plasma-DNA tot een concentratie tussen de 50 en 200 µg/mL in injectiebuffer. Voeg vervolgens Oregon Green 488 (OG) geconjugeerd aan 70 kDa dextran toe aan het mengsel om de geïnjecteerde cellen te kunnen identificeren.

Het OG-geconjugeerde dextraan helpt bepalen hoeveel van de vloeistof in de nucleus is geïnjecteerd en hoeveel er is gelekt naar het cytoplasma. Centrifugeer de monsters bij 13.000 G en vier graden Celsius gedurende ten minste 20 minuten om eventuele vaste bestanddelen die de naaldpunt kunnen blokkeren te pelletteren. Kies de zoogdiercellijn voor micro-injectie op basis van de criteria die in het geschreven protocol worden beschreven.

Zeven cellen worden gebruikt voor dit demonstratie-zaadje. De cellen worden op zuurgewassen dekglasjes in Petri-schalen van 30 millimeter geplaatst, ten minste 24 uur vóór de microinjectie. Idealiter moet de cellaag op het moment van injectie ongeveer 70 tot 90% confluent zijn om een eenvoudige identificatie van de geïnjecteerde cellen mogelijk te maken; de cellaag wordt vóór de injectie gewond met behulp van een plastic pipetpunt van 200 microliter.

Ets een kruisvormige wond in het dekglas en laat de cellen minimaal 15 minuten herstellen in de weefselkweekincubator vóór de injectie. Gebruik voor micro-injectie een omgekeerde microscoop die op een luchttafel is geïsoleerd om trillingen te minimaliseren die het micro-injectieproces kunnen verstoren. Verwijder met een einor gel-laadpunt ongeveer één microliter van de bovenkant van het centrifugemonster om te voorkomen dat het pellet wordt verstoord.

Plaats de punt van de pipet in het uiteinde van een geprefabriceerde micro-injectienaald en breng de vloeistof over. De vloeistof zal door capillaire werking in de naaldpunt worden getrokken. Binnen vijf tot 30 seconden moet een meniscus nabij de punt zichtbaar worden.

Plaats de met vloeistof gevulde naald in de houder en klem deze vast aan de micromanipulator. Visualiseer de naald onder een hoek van 45 graden met behulp van het 10 x objectief en positioneer deze in het midden van het gezichtsveld nabij het brandvlak. De houder is via een slang verbonden met een glazen spuit, die wordt gebruikt om de druk te genereren die nodig is om de vloeistof uit de naaldpunt te stoten, waarbij de grove knoppen van de micromanipulator worden gebruikt.

Om een constante druk te handhaven, wordt de spuit op een buisklem gemonteerd. Gebruik twee rubberen stoppers en twee metalen klemmen om de naald een paar millimeter op te tillen, zodat deze in latere stappen niet beschadigd raakt, en schuif vervolgens de microscoopsteun terug. Verhoog de druk door de zuiger van de spuit in te drukken.

0,5 tot twee kubieke centimeter. Plaats een petrischaal met een dekglas met een gewonde monolaag. Trek de microscoop op de objecttafel naar achteren.

Beweeg de pilaar naar voren naar een rechtopstaande positie, zodat de condensor is uitgelijnd waardoor de naald de vloeistof kan binnendringen. Dit moet voorzichtig gebeuren om te voorkomen dat de naald breekt op het dekglas. Identificeer met het 10 x objectief het centrum van de kruiswond en positioneer de naald boven de te injecteren cellen.

Verhoog de vergroting door over te schakelen naar het 40 x objectief. Breng de naald vervolgens naar beneden en centreer deze met behulp van de fijninstelknoppen op de joystick. Begin de injectie in één hoek van het wondkruis door de naald te laten zakken tot deze contact maakt met de nucleus.

Zodra een cel is geïnjecteerd, vertoont deze een opvallende verandering in fasehelderheid. Ga verder langs één rand van het wondkruis. Voor een gemakkelijke identificatie van geïnjecteerde cellen tijdens de visualisatie is het essentieel dat de injectiedruk correct wordt ingesteld voor elke naald.

De druk moet hoog genoeg zijn om het plasmamembraan en het kernmembraan te doorboren, maar niet zo hoog dat de cellen afsterven. Micro-injecteer cellen langs de wondrand gedurende een vaste periode. Met oefening kunnen er tijdens dit interval honderden cellen worden geïnjecteerd.

Indien er plasmisch DNA wordt geïnjecteerd, incubeer de micro-geïnjecteerde cellen dan gedurende 20 minuten bij 37 °C in een weefselkweekincubator vóór de fixatie, en beëindig vervolgens de transcriptie. Behandel de cellen hiervoor met 1 µg/mL α-amanitine opgelost in groeimedium. Deze concentratie remt de transcriptie vanuit de micro-geïnjecteerde plasmiden effectief.

Plaats de cellen terug in de incubator en laat de cellen het nieuw gesynthetiseerde mRNA exporteren. Eén enkele naald kan opnieuw worden gebruikt om meerdere dekglasjes te injecteren. De naald moet echter worden vervangen wanneer het type DNA of RNA dat wordt gemicro-injecteerd is gewijzigd.

Bovendien moet de naald, zodra deze uit de wand is verwijderd, worden weggegooid om een nauwkeurige meting van de mRNA-nucleaire exportkinetiek te verkrijgen. Aparte monsters moeten worden gefixeerd op nul minuten, 15 minuten, 30 minuten, 60 minuten en 120 minuten. Na de behandeling met alpha manine op het juiste tijdstip, wordt het groeimedium weggezogen en worden de cellen twee keer gewassen in twee milliliters PBS-oplossing.

Het is belangrijk om de dekglasjes vochtig te houden door de tijd dat ze niet in vloeistof zijn ondergedompeld te minimaliseren. Fixeer de cellen door twee milliliters 4% Aldehyde in PBS toe te voegen en incubeer de cellen gedurende ten minste 15 minuten bij kamertemperatuur. Na het nog twee keer wassen van de gefixeerde monsters, maak de cellen permeabel met twee milliliters 0,1% Triton X 100 in PBS en incubeer de cellen opnieuw gedurende ten minste 15 minuten bij kamertemperatuur.

Was de monsters ten slotte nog twee keer om ze voor te bereiden op hybridisatie. Was de cellen twee keer met een wasbuffer van een 1X SSC-oplossing die 25 tot 60% formamide bevat. Bereid vervolgens de kleurkamer voor op hybridisatie door de bodem van een Petri-schaal van 150 millimeter te bedekken met water en er een stuk parafilm bovenop te laten drijven.

Verwijder het water door de schaal om te keren, zodat de paraform aan de bodem van de schaal hecht. Verwijder handmatig eventuele luchtbellen van elk dekglas dat gekleurd moet worden. Pipetteer druppels van 100 µL van de hybridisatielosie op de paraform.

Let op dat de hoeveelheid formage met behulp van een pincet moet worden geoptimaliseerd voor de specifieke gebruikte vissoort. Verwijder een dekglas met de gefixeerde cellen uit de Petri-schaal van 30 millimeter. Droog de achterzijde van het dekglas met Whatman-filterpapier en absorbeer overtollige buffer van de voorzijde zonder de cellen uit te drogen.

Plaats vervolgens het dekglas met de zijde die naar beneden wijst op de visoplossing. Herhaal dit proces voor elk dekglas. Nadat het deksel van de kleurkamers is teruggeplaatst, worden de monsters vijf tot 18 uur geïncubeerd bij 37 °C.

Bereid verschillende waskamers op dezelfde manier voor als de kleurkamer werd voorbereid. Pipetteer voor elk dekglas één milliliter wasbuffer op het parafilm van de waskamer. Verwijder na incubatie de dekglazen uit de kleurkamer door één milliliter wasbuffer te pipetteren. Naast het dekglas moet de vloeistof door capillaire werking onder elk monster worden getrokken.

Verwijder vervolgens de dekglasjes met een pincet en plaats elk dekglasje op een druppel wasbuffer die vijf minuten op kamertemperatuur is geïncubeerd. Was elk dekglasje nog twee keer, voor een totaal van drie wasbeurten per dekglasje. Pipetteer 10 tot 30 µL monteermiddel met DAPI op een eerder gewassen objectglas. Elk objectglas kan twee dekglasjes accommoderen met behulp van een pincet en Watman-filterpapier.

Droog de achterkant van de dekglasjes en absorbeer overtollige vloeistof van de voorkant van het dekglasje zonder de monsters uit te drogen. Plaats elk dekglasje met de voorkant naar beneden op een druppel monteervloeistof. Gemonteerde monsters kunnen worden bewaard bij vier graden Celsius.

Hier zijn de effecten van alfa-mantine op de transcriptie van geïnjecteerd plasmide-DNA getoond in NIH 3T3-fibroblastcellen, die waren voorbehandeld met verschillende concentraties alfa-mantine. Deze werden geïnjecteerd met TFL s delta i plasmide-DNA en OG-geconjugeerd 70 kDa dextraan. Elke rij komt overeen met één beeldveld dat is gefotografeerd voor OG 70 kilodalton dextraan en T uts delta I mRNA.

Het is duidelijk dat hoge concentraties van het geneesmiddel de productie van het T UTS delta I-transcript volledig remden, terwijl dit bij lagere concentraties niet werd waargenomen. Hier wordt een tijdlijn van de kosten van nucleair mRNA-transport getoond. Zeven cellen werden geïnjecteerd met T UTS delta i plasma-DNA en OG-geconjugeerd 70 kilodalton dextran.

30 minuten na de injectie van de cellen werden deze behandeld met alfa-mantine en geïncubeerd bij 37 °C gedurende 0 minuten, 60 minuten en 120 minuten. De cellen werden vervolgens gefixeerd en gekleurd met een probe tegen T UTS delta I mRNA en met antilichamen tegen de ER-marker trap alfa; elke rij komt overeen met een enkel cellenveld.

Raadpleeg de online tekst hier voor informatie over het kwantificeren van mRNA-export. Het tijdstip van 120 minuten is vergroot. Om de colocalisatie van TFS delta I mRNA in het ER aan te tonen, wordt een overlay getoond van het T UTS delta I mRNA in het groen en trap alfa in het rood. Informatie over het co-kleuren van mRNA met eiwitten is te vinden in de online tekst.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe de nucleaire exportkinetiek van mRNA kan worden gemeten via micro-injectie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een succesvolle micro-injectie een zorgvuldige voorbereiding vereist. Cruciale stappen zoals de monsterbereiding van DNA en RNA, het trekken van naalden, het uitlijnen van de optische apparatuur en het oplossen van problemen bij micro-injectie worden beschreven in ons geschreven protocol.

Bij het afbeelden en analyseren van micro-geïnjecteerd mRNA is het belangrijk dat de kwantificering beperkt blijft tot cellen waarin meer dan 90% van het geïnjecteerde vloeistof in de nucleus is terechtgekomen. Een succesvolle nucleaire injectie kan worden beoordeeld door de distributie van organ green dextran in de nucleus en het cytoplasma te visualiseren. Raadpleeg ons online protocol voor meer informatie over het ontwerpen van vis-probes en het gebruik van beeldanalyse-software voor het analyseren van de distributie van mRNA in het cytoplasma en de nucleus.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.