Methoden voor Patch Clamp capaciteit Recordings uit de Calyx

Hallo, mijn naam is Ken Paradiso. Ik werk voor Ling Gang Wu bij het intramurale programma van het National Institute of Neurological Disorders and Stroke, gevestigd op de NIH-campus in Bethesda. Ik ga u de technieken laten zien voor presynaptische opname via patch-clamp in de calyx.

Om het hersenweefsel voor te bereiden, verwijderen we de hersenen uit de rat. We plaatsen de hersenen in deze oplossing, een ijskoude calciumarme oplossing, die wordt gebubbelt met carbogeen om ervoor te zorgen dat er te allen tijde een zuurstoftoevoer naar de hersenen is. Bovendien moet de oplossing ijskoud zijn om de hoeveelheid schade te minimaliseren.

De hersenen bevinden zich nu in deze oplossing. We halen ze eruit, snijden ze op de juiste manier zodat ze op het blok geplaatst kunnen worden, en monteren ze op het blok met Sano correlate of secondelijm. Vul de kamer vervolgens met ijskoude, calciumarme oplossing, belucht deze, plaats het geheel op de vibratie-unit en snijd vervolgens coupes met een dikte van 180 tot 190 microns bij een mesfrequentie van 70 hertz en een voorwaartse voortstuwingssnelheid van 0,01 tot 0,02 millimeters per seconde. Dat komt neer op 10 tot 20 microns per seconde.

Zodra elke plak is gemaakt, brengen we de plakken over van de ijskoude zoutoplossing naar deze kamer, die een normale calciumoplossing bevat. Dit is dezelfde oplossing waarin we registreren en deze bevindt zich op een fysiologische temperatuur van 37 °C. Vervolgens plaatsen we de plakken hierin voor herstel.

Het blijft hier een half uur tot een uur in voordat de fysiologische experimenten worden uitgevoerd. Hier heb ik het brein en ik ga het uit de oplossing halen. Voor demonstratiedoeleinden gebruik ik hier een groter brein.

Dit is van een P 20 rat. We zullen deze omdraaien. De hersenstam is waar we in geïnteresseerd zijn.

Dit gebied hieronder en de calyx zijn in dat gebied daar behouden. We gaan nu de rest van de hersenen wegsnijden, de hersenstam isoleren en vervolgens de hersenstam voorbereiden voor de slicekamer. Oké, we snijden nu de rest van de hersenen weg om alleen de hersenstam te isoleren.

Ik ga het nu omkeren om te laten zien waar we zijn. Normaal gesproken zouden we het niet op deze manier doen, en we kunnen dat hele gedeelte simpelweg verwijderen. Terwijl we het weer terugdraaien, hebben we de hersenstam geïsoleerd en we maken nu direct daar nog een snee.

Oké, dat is alles. Dat is de hersenstam. De calyx van Held bevindt zich ongeveer daar en daar.

Dit is de hersenstam. We zullen deze opnieuw een beetje naar achteren duwen. We gaan één zijde van het cerebellum afknippen, zodat de hersenstam als zodanig zijwaarts kan liggen.

We brengen een kleine hoeveelheid Sano acryliⱼlijm aan en vullen het, terwijl we het op zijn zij houden, snel op met koud ijs en een koude laag-calciumoplossing. Plaats de zuurstoflijn zo snel mogelijk. We tillen het nu op en brengen het naar de vibrator.

We brengen het snel naar het begin van de hersenen, en zodra we het begin van de hersenen bereiken, verlagen we de snelheid naar 0,01 millimeter per seconde. Dat is 10 micros per seconde. Het beweegt dus met een ongelooflijk lage snelheid.

Het eerste gedeelte van de hersenen is het deel met de mtb, de mediale nucleus van het trapezoïde lichaam. Dat is het deel dat de, oké, zodra ik het in de transferpipet heb, probeer ik het zo dicht mogelijk bij de punt van de pipet te brengen. Hier is de plak hersenweefsel en ik breng deze vrij snel over naar deze kamer, die een standaard registratie-oplossing bevat met normale calciumgehaltes en een hogere temperatuur.

Dit stelt de coupes in staat om te herstellen na de snijprocedures, zodat ze gereed zijn voor fysiologische experimenten. Oké, vanaf dit punt zal het proces zich herhalen. De volgende apparatuur zal ik gebruiken om de patch clamping uit te voeren.

We hebben een oprechte microscoop met een vaste tafel. De tafel is, zoals ik al zei, vast, waardoor de microscoop eronder beweegt via een manipulator. We gebruiken een Wiggins en Newman micromanipulator om de tafel vast te houden; voor de kop van de versterker gebruiken we een EPC 10 patchclamp-versterker van HEKA.

En wat ik ook nog had moeten vermelden, is dat we DIC met infraroodlicht gebruiken. We hebben hier dus een IR-camera, waardoor alles wat we zien op het scherm verschijnt wanneer we op zoek gaan naar CAE's. De patchclamp-versterker wordt aangestuurd door deze software, genaamd Pulse, die ook van Heca is; hiermee worden de versterker en het gehele fysiologische experiment beheerd.

De resultaten verschijnen op dit scherm. De calyx die we hebben vastgehouden is een groot presynaptisch axonale terminal, en omdat deze groot is, stelt het ons in staat om fysiek een patch op de terminal te plaatsen. Hierdoor kunnen we presynaptische opnames maken, wat een vrij unieke mogelijkheid is, vooral in het CZS.

Hiermee kunnen we presynaptisch geactiveerde calciumkanalen meten. Daarnaast kunnen we ook de actiepotentiaalactiviteit meten als we het zenuwsegment willen stimuleren dat naar de calyx leidt. Wat we in dit laboratorium doen, is het meten van een proces genaamd exocytose, wat de fusie is van blaasjes die neurotransmitters bevatten met het membraan.

Wanneer deze blaasjes vervolgens fuseren met het membraan in het proces dat exocytose wordt genoemd, voegen ze membraan toe aan het synaptische uiteinde, wat we kunnen meten als een verandering in capacitantie. We zien een toename in capacitantie naarmate er membraan aan het uiteinde wordt toegevoegd; de experimenten die ik vandaag zal laten zien zijn dus capacitantiemetingen, presynaptisch wanneer het membraan wordt verwijderd. Je kunt immers niet constant membraan blijven toevoegen, er moet er natuurlijk ook weer wat worden verwijderd.

Dat proces wordt endocytose of membraanopname genoemd. We kunnen dit ook meten, wat zich zal uiten als een afname van het capaciteitsniveau; we zullen daar later voorbeelden van tonen. Wat dit ons nu in staat stelt, is om de activiteit van calciumkanalen te monitoren en ook enkele van de eiwitten die betrokken zijn bij exocytose en endocytose te monitoren en te bestuderen.

We kunnen stoffen zoals peptiden toevoegen om eiwitten te blokkeren die betrokken zijn bij exo- of endocytose. We kunnen ook toxines gebruiken die hetzelfde effect hebben. Daarnaast kunnen we de hoeveelheden calcium die de terminus binnenkomen aanpassen, zodat we het proces van exocytose, de afgifte van neurotransmitters, en de daaropvolgende opname van het membraan nauwkeurig kunnen bestuderen.

Dit is de buis met onze intracellulaire registratie-oplossing. We bereiden deze vooraf en vriezen deze vervolgens in; meestal kunnen we de oplossing enkele weken tot een maand gebruiken voordat er een nieuwe oplossing gemaakt moet worden. We hebben deze opnieuw ontdooid vlak voordat we aan de registraties begonnen, aangezien er altijd een bepaalde hoeveelheid stofdeeltjes of ander type residu in de buis terechtkomt.

U kunt een van twee dingen doen. U kunt de oplossing eruit halen en filteren, of u kunt deze een minuut of twee centrifugeren en vervolgens de oplossing afnemen, waarbij een bodemfractie overblijft waarin debris en ander materiaal zich bevinden. Ik geef er de voorkeur aan om te centrifugeren en dat zal ik nu doen.

Dit is de buis met onze intracellulaire oplossing. Deze is ontdooid. We gaan deze ongeveer twee tot drie minuten centrifugeren in een kleine centrifuge, wat voldoende zou moeten zijn om eventuele grote stofdeeltjes uit de oplossing te verwijderen.

Vervolgens verwijder ik de bovenste laag, de oplossing die we zojuist hebben gecentrifugeerd, waarbij ik er voorzichtig op let deze niet te schudden, en breng ik ongeveer 90% hiervan over naar een schone buis. Ik probeer opnieuw het laatste beetje niet mee te nemen. Dus ik stop ongeveer daar.

Dit zet ik onmiddellijk op ijs, zodat het tijdens het experiment mooi koud blijft. Dat is zeer belangrijk. Dit is een van onze pipetten.

We gebruiken dit voor intracellulaire registraties. Het is silica-glas met een dikke wand, een buitendiameter van twee millimeter en een binnendiameter van 1,16 millimeter. De eerste stap is het vullen van de pipet vanaf de achterzijde.

Vervolgens passen we zuigkracht toe; we plaatsen de pipet in de opname-oplossing en zuigen om de uiterste punt van de pipet te vullen, wat anders op geen enkele andere manier mogelijk is. Nadat we dit hebben gedaan, nemen we een capillaire buis en vullen we de rest van de elektrode door de achterkant van de pipet te gebruiken. Dit is een standaard fysiologische techniek waarbij de vloeistof er simpelweg uit wordt getikt.

U loopt het risico de punt van de pipet te breken, maar als u dat niet doet, krijgt u vaak luchtbellen. Oké, we plaatsen deze nu op onze pipethouder, die is verbonden met de headstage van de patch-clamp versterker. Daar bevindt zich een zilverchloride-draad.

De zilverchloridedraad komt in contact met de intracellulaire oplossing, waardoor we de elektrische activiteit in de presynaptische terminal kunnen meten. We zoeken daarom een coupeselectie met veel CAE's; we streven naar een hoge dichtheid van CAE's.

Dus we zoeken naar de mediale nucleus van het trapezoïde lichaam, de MNTB, en dat is waar de terminalis, die de calyx appendicularis vormt of die de calyx app. is, zich bevindt. Wat we nu doen, is door de coupes scannen. Daar hebben we bijvoorbeeld een calyx die iets dieper onder het oppervlak ligt en waar weinig aan vast te hechten valt, dus we scannen gewoon verder over de coupes.

Dit is de kelk die we gaan gebruiken. Ik heb twee markeringen op het scherm gemaakt, waar de pipet zal komen. En u kunt zien dat daar het stukje kelk is waar ik mee ga werken zodra de pipet naar beneden komt.

Ik ga een positieve druk uitoefenen zodat deze tegen de calyx drukt, en vervolgens zal ik de positieve druk wegnemen. De calyx zal dan tegen de pipet drukken, en op dat punt pas ik een zeer zachte zuiging toe en probeer ik het membraan op te zuigen en te duwen, of het membraan zodanig te laten afsluiten op de pipetpunt. Oké, de positieve druk is weggenomen.

En nu ga ik zuiging toepassen. Hier passen we een puls van 5 millivolt toe, of eigenlijk een puls van 4 millivolt. Oké, dat is het. Oké.

Nu verlagen we de membraanpotentiaal naar minus 80, om de snelle transiënte piek te annuleren. Nu gaan we over op de whole-cell modus. Ik ga een voorzichtige zuigkracht toepassen en proberen de whole-cell configuratie te bereiken.

Die laadtransiënten geven aan dat de pipet en de cel nu continu zijn, dat er een volledige registratie is verkregen. Dat is nog een prachtig beeld. De lichtrode lijn was de capaciteitsspoor, en je kunt zien dat er een plotselinge sprong is en dat deze vervolgens afnam.

Ik heb u zojuist de basistechnieken laten zien voor het verkrijgen van opnames van een calyx-houdende presynaptische terminal. Ik heb u laten zien hoe u coupes maakt die de nucleus medialis van het corpus trapezoideum bevatten. Dat is waar u de calyxen vindt.

En ik heb u de technieken laten zien om door de coupes te kijken. U gaat door elke coupe heen op zoek naar de coupe met het grootste aantal calyces op het oppervlak. Vervolgens zoekt u naar het grootste calyxmembraan dat u kunt vinden om daar een patchclamp-meting op uit te voeren.

En ik heb u ook de technieken voor patchclamp-registraties getoond, en dat zijn standaard patchclamp-registratietechnieken.