Evaluatie van kankerstamcel Migratie Met behulp van compartimentering microfluïdische apparaten en live cell imaging

Het algemene doel van deze procedure is om de migratie van kankercellen door een compartimenterend microfluïdisch apparaat visueel te inspecteren en te karakteriseren. Dit wordt bereikt door eerst reeds bestaande neurosferen van hersentumorstamcellen, gekweekt in serumvrij medium, te dissociëren. De tweede stap is het vervaardigen van een dubbellaagse SU-8 master en het gebruik van zachte lithografie om een PDMS-stempel te maken met een compartimenterend ontwerp.

Assembleer vervolgens het microfluïdische apparaat en laad het met hersentumorstamcellen. Ten slotte wordt langdurige time-lapse imaging van de migratie van hersentumorstamcellen uitgevoerd met behulp van een all-in-one microscopiesysteem. Uiteindelijk laten de resultaten zien dat hersentumorstamcellen een terugkerende sequentie van morfologische stadia vertonen tijdens hun migratie door een ultra-beperkte ruimte.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande systemen zoals de Transwell Boyton Chamber, is dat micro-apparaten visuele inspectie van het migratieproces, gecontroleerde plaatsing van cellen en de nauwkeurige toediening van factoren mogelijk maken. Daarom beschikt microfluidische technologie over kenmerken voor betrouwbare, efficiënte en kosteneffectieve selectie en navigatie van individuele cellen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van kankermetastasen en recidieven, aangezien analyse van individuele, sterk migrerende cellen potentiële toekomstige chemotherapeutische doelwitten kan identificeren.

Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in het migratiegedrag van kankersystemen, kan ze ook worden toegepast op andere systemen, zoals embryonale ontwikkeling, immuunresponsen, wondgenezing en orgaanregeneratie. Begin met de celsuspensie van uit BTSC afgeleide neurosferen. Verzamel de cellen in een conische buis van 15 ml en centrifugeer deze gedurende vijf minuten bij 900 RPM, maar niet sneller.

Pipetteer het supernatant af. Laat de neurosfere vervolgens loskomen door deze vijf tot 10 minuten te incuberen in 0,5 milliliters voorverwarmd Accutane bij 37 °C. Ontricht de cellen na de incubatie mechanisch met 10 tot 20 voorzichtige bewegingen van een P 100 pipette.

Voeg vervolgens 1,5 milliliters stamcelmedium toe om de Accutane te neutraliseren, centrifugeer de celsuspensie bij 1300 RPM gedurende vijf minuten en resuspendeer de cellen in één milliliter stamcelmedium. Controleer de celdichtheid met een hemocytometer en stel de dichtheid bij naar 20 000 cellen per microliter. Om te beginnen met de vervaardiging van de SU-8 master, worden twee fotomaskers voorbereid met Adobe Illustrator en laserprint-transparantiefolie met behulp van een Image Setter.

Het fotomasker van de eerste laag bestaat uit twee referentiemarkeringen en een reeks microkanalen, en het fotomasker van de tweede laag bevat de zitting- en ontvangstkamers. Reinig beide maskerlagen met isopropanol en laat ze aan de lucht drogen. Spin-coat vervolgens een handle-wafer met een SU-8 fotorezist met een dikte van drie micron, gevolgd door een soft-bake.

Belicht vervolgens de fotorezist met het fotomasker voor de eerste laag in nauw contact met uv-licht en laat deze uitharden. Voer daarna een post-bake uit en ontwikkel de uitgeharde wafer. Bedek de gebieden met de fiduciale markeringen van de handle wafer met plakband.

Breng vervolgens met spin-coating een fotoresistlaag van 250 micron dik aan op de wafer. Verwijder daarna de tape om de markeringen voor de uitlijning zichtbaar te maken. Breng de tweede laag fotoresist aan en lijn de referentiemarkeringen uit.

Belicht vervolgens de tweede laag van het fotomasker met UV-licht en hard deze, gevolgd door nabakken en ontwikkelen. Behandel nu de SU-8 master via dampafzetting om de kleverigheid van het oppervlak te verminderen. Plaats de wafers in een desiccator met enkele druppels trichlooretheenoplossing onder vacuüm gedurende ten minste één uur.

De mal is nu klaar voor gebruik om PDMS met de mal te gieten. Begin met het grondig mengen van de prepolymeerbasis met de harder in een verhouding van 10 op 1. Plaats het mengsel vervolgens in een vacuümdroger voor vacuümontgassing totdat er geen luchtbellen meer zichtbaar zijn.

Giet het mengsel op het masker en ontgas het opnieuw. Als er nieuwe luchtbellen zijn ontstaan, laat de mal dan twee uur uitharden op een vlakke warmteplaat bij 90 °C. Nadat het is afgekoeld tot kamertemperatuur, wordt de PDMS-stempel voorzichtig losgemaakt.

De kweekkanalen zijn hiermee in het PDMS gegraveerd en klaar voor de assemblage van het microfluïdische apparaat. De master is herbruikbaar voor het gieten totdat deze barst of versleten is. Wanneer de master plakkerig wordt, kan de anti-aanbaklaag opnieuw worden aangebracht.

Begin met het maken van in- en uitlaten in het microfluïdische apparaat via de PDMS-stempel. Reinig de PDMS-stempel door deze 30 minuten te weken in 70% ethanol en vervolgens 10 minuten te spoelen met gedeïoniseerd water met behulp van een biopsiepons. Steriliseer de PDMS-stempel en voltooi de cross-link reacties via autoclaveren.

Plaats nu de PDMS-stempel op een glazen dekglas dat is gecoat met poly-L-lysine. Het apparaat wordt vervolgens gecoat met laminaat door de kamers via de reservoiringangen te vullen met laminaatoplossing, waarna het gedurende de nacht wordt geïncubeerd bij 37 °C. Aspireer de volgende dag het laminaat uit het apparaat.

Was vervolgens het apparaat door het twee keer te spoelen met stamcelmedium. Laad nu 11 µL gedissocieerde cellen in een van de zaaireservoirs. Gebruik indien nodig vacuümaspiratie om de cellen de kamer in te dwingen. Laad vervolgens nog eens zeven µL cellen in het aangrenzende zaaireservoir.

Na vijf minuten zullen de zittings- en ontvangstreservoirs gevuld zijn met medium. Plaats nu een steriele PDMS-plaat met een dikte van 0,5 tot 1 millimeter op het apparaat. De natuurlijke oppervlakteadhesie van PDMS aan zichzelf zal het apparaat afsluiten; zodra het is afgedicht, is het klaar voor transport, incubatie en microscopische beeldvorming.

Pre-equilibreer de biot, IM door deze 45 minuten te laten draaien. Voeg meerdere schaaltjes water toe aan de monsterkamer om de juiste luchtvochtigheid te verkrijgen en zo de temperatuur, vochtigheid en luchttoevoer te stabiliseren. Plaats het voorbereide apparaat in de monsterkamer van de microscoop.

Centreer het apparaat met behulp van micro-pincetten. Stel nu de focuspositiepunten en tijdspunten in met de Biot-software en start indien nodig de time-lapse opnames. Vervang na vijf dagen in cultuur het cultuurmedium.

De BTC's die in het apparaat waren gezaaid, werden continu vastgelegd met fasencontrastbeelden. Gedurende vijf dagen in de behuizingskamer bleven spoelvormige cellen in het pre-migratie stadium. Terwijl ze de ingang van het microkanaal naderden, zetten enkele cellen uit en vormden zij adhesieve uitlopers.

Slechts één cel kon de ingang bezetten en de migratierichting verkennen. Zodra de cel de migratierichting had bepaald, bewoog deze zich met een constante hoge snelheid door het volledige microkanaal. Aan het einde van het microkanaal verkende de cel de open ruimte van de ontvangstkamer voordat deze daar uiteindelijk binnentrad.

Door de cellen te observeren met twee seconden tussen de beeldopnames, leek de migratiekracht hoofdzakelijk te worden gegenereerd door blabbing-activiteit, vergelijkbaar met die van OID-cellen. Bij het uitvoeren van de procedure is het belangrijk om te onthouden dat het ontwerp van het apparaat zo flexibel is dat de afmetingen van het microkanaal kunnen worden aangepast om een gewenste mate van celmigratie te bereiken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een uniek compartimenterend microfluidisch apparaat kunt maken dat geschikt is voor het kweken van de door u gewenste cellen, om vervolgens langdurige time-lapse-beeldvorming uit te voeren om de migratiekenmerken van deze cellen na deze procedure kwalitatief en kwantitatief te definiëren.

Andere methoden, zoals next generation sequencing of DNA-microarrays, kunnen worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals in hoeverre de sterk migrerende kankercellen genetisch verschillend zijn.