Experimentele Endocarditis Model van Methicilline Resistente

Het algemene doel van deze procedure is om een experimenteel model voor infectieuze endocarditis bij ratten op te zetten. Dit wordt bereikt door eerst aureus te kweken en chirurgische katheters voor de infectie voor te bereiden. Vervolgens wordt het operatiegebied voorbereid en wordt het dier onder narcose gebracht.

Zodra het dier is geanestheseerd, wordt een katheter via de rechter arteria carotis in de richting van het hart geplaatst. De laatste stap is het infecteren van de dieren met aureus via een injectie in de staartвена. Uiteindelijk worden de doelweefsels gedissecteerd en klaargemaakt voor kwantitatieve kweek.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals een snel endocarditismodel, is dat het rode endocarditismodel kan worden gebruikt met het in vivo beeldvormingssysteem Ivus. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de orale pathogenese, zoals virulentie en de effectiviteit van antimicrobiële middelen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek moeite hebben, aangezien de chirurgische procedure uitdagend is.

Inoculeer eerst een lus vol M SSA-cultuur vanuit een bevroren voorraad in een schapenbloed-tripcase. Incubeer de cultuur overnacht bij 37 °C op een soja-agarplaat nadat is vastgesteld dat er geen contaminatie aanwezig is. Selecteer één kolonie van de plaat en gebruik deze om vijf milliliter trypto-sojabouillon in een snap-cap buis van 15 milliliter te inoculeren.

Incubeer het inoculum gedurende de nacht bij 37 °C in een schudincubator. Stel deze in op 200 RPM. Bereid eerst de katheters door polyethyleenslangen in stukken van 10 centimeter te snijden en de katheters gedurende 30 minuten te steriliseren in een cex-desinfectieoplossing.

Smelt vervolgens één uiteinde van een gesteriliseerde buis door de punt met verhitte steriele pincetten samen te drukken om een katheter te maken die vanuit de rechter arteria carotis in de linker ventrikel zal lopen en het endocard zal beschadigen wanneer het hart slaat. Anestheseer daarna de rat door deze in een kamer te plaatsen met een mengsel van isofluraan en zuurstof in een verhouding van één-op-één tot het anestheticum is ingetreden. Bevestig de anesthesie door te controleren of de spieren ontspannen zijn en de pedaalreflexen ontbreken.

Behoud een staat van anesthesie tijdens de operatie door gebruik te maken van een neusconus die is verbonden met het gasmengsel. Reinig het operatiegebied met Betadine en 70%ethanol met behulp van steriele technieken gedurende de gehele operatie. Plaats de rat in rugligging en maak een verticale incisie door de huidlaag van de nek boven het sternum middels botte dissectie.

Scheid de fascia om de rechter arteria carotis bloot te leggen. De rechter arteria carotis bevindt zich net rechts van de middellijn boven de claviculae. Trek de arterie voorzichtig uit de halsvacuüm omhoog en plaats twee stukken zijden hechtmateriaal van 10 centimeter onder de arterie om deze aan het blootgelegde cefale uiteinde af te binden.

Plaats vervolgens een clip op de slagader om bloedingen te voorkomen. Maak met een pincet een klein gaatje in de bovenkant van de slagader met behulp van een katheterintroducer. Voer het open uiteinde van de katheter door het gaatje in de slagader.

Verwijder de klem en duw de katheter richting het hart. De katheter moet vier tot vijf centimeter in de slagader worden ingebracht totdat er weerstand wordt gevoeld, wat aangeeft dat deze correct is geplaatst; de katheter moet pulseren met de hartslag van de rat. Zodra de katheter op zijn plaats zit, wordt een losse hechting rond het uiteinde van de slagader geknoopt om de katheter te fixeren.

Knip met een zijden hechtdraad de overtollige hechting en de uiteinden van de katheter af en stik de uiteinden vervolgens onder de huid van de nek. Sluit de huid met huidclips. Plaats de rat in een schone kooi en houd deze op een warme plaats tot het dier volledig is hersteld van de anesthesie.

Zorg voor voedsel en water en controleer de rat regelmatig, zowel tijdens als na het herstel. De infectie kan tussen één en zeven dagen na de operatie worden uitgevoerd, maar de timing moet consistent blijven binnen experimenten. Maak de staart van de rat schoon met 70% ethanol en injecteer 0,5 milliliters van de MRSA-cultuur bij de gewenste cel.

Injecteer in de staartвена. Gebruik een naald van 27 gauge en een halve inch en oefen druk uit op de injectieplaats totdat alle bloedingen zijn gestopt voordat de rat terug in de kooi wordt geplaatst. Veeg na het opofferen van de rat de borstkas af met 70%ethanol en maak vervolgens een V-vormige incisie in de borstkas onder het borstbeen.

Snijd het kraakbeen van de ribben aan beide zijden van het borstbeen door. Om het hart bloot te leggen, trekt u het hart voorzichtig omhoog, knipt u door het weefsel dicht bij de aorta en disseceert u naar boven om het hart vrij te maken. Plaats het hart in een steriele petrischaal bekleed met gaas van tien bij tien centimeter, en maak vervolgens een insnede door de binnenwand van de linker ventrikel om de linkerkamer te openen.

Controleer of de katheter correct is geplaatst en verwijder deze vervolgens. Onderzoek de klep en verwijder vegetaties met een schaar en pincet. Verwijder daarnaast de nieren en de milt; weeg en homogeniseer de weefsels en vegetaties en maak vervolgens seriële verdunningen in PBS voor kwantitatieve kweek.

Hier wordt een correct geplaatste katheter getoond, zoals aangegeven door de meest linkse pijl. Deze loopt over de aortaklep en in de linkerhartkamer, en rond de aortaklappen zijn talrijke vegetaties zichtbaar, zoals aangegeven door de middelste en rechter pijl. Deze tabel geeft een voorbeeld van de virulentie van een ssus-stam in het ratmodel voor endocarditis.

Alle dieren die waren geïnoculeerd met 10⁵ en 10⁶ CFU ontwikkelden endocarditis met hoge densiteiten van ssus in de cardiale vegetaties, evenals in de nieren en milt. Zodra deze chirurgische procedure onder de knie is, kan deze binnen 10 minuten worden uitgevoerd mits deze correct wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het dier gedurende de operatie in een beoordeelde toestand moet worden gehouden. Na deze procedure kunnen methoden zoals ivus worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals real-time monitoring van de effectiviteit van antimicrobiële middelen en de in vivo genexpressie na de ontwikkeling ervan. Deze techniek kan voor onderzoekers in het veld van stap orus en fictie de manier zijn om de pathogene virulentiefactoren bij endovasculaire infecties te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in het opzetten van een experimenteel endocarditismodel bij ratten. Vergeet niet dat werken met MRA uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van een laboratoriumjas en handschoenen, moeten worden getroffen tijdens het uitvoeren van deze procedure.