Monogene Assay: hechtende cellen

Hoi, mijn naam is Lum en ik promoveer momenteel aan het BE IDI Heart and Diabetes Institute onder supervisie van dr. Tom Carianne, hoofd van het Epigenomic Medicine Lab. In deze video demonstreer ik de procedure die bekendstaat als de Clonogenieke Overlevingstest. Dit is een 50 jaar oude techniek waarmee de impact van verschillende behandelingen, zoals blootstelling aan straling of chemische agentia, op de reproductieve levensvatbaarheid van cellen kan worden beoordeeld.

De congene overlevingstest is een centrale techniek in de stralingsbiologie voor het evalueren van de stralingsgevoeligheid van verschillende cellijnen en het testen van de effectiviteit van verschillende radioprotectieve of radiosensitiserende verbindingen. Bij het gebruik van een adherente cellijn bestaat de cryogene overlevingstest uit drie fasen. Ten eerste de behandeling van een monolaag van adherente cellen.

Ten tweede, de bereiding van een enkelcel-suspensie en het uitplaten van een bekend aantal cellen in voorbehandelde schalen, en ten derde, het kleuren, tellen en bepalen van de gevormde kolonies na een incubatieperiode. In deze video zal ik geïmmortaliseerde menselijke synoviale cellen gebruiken om te demonstren hoe een polygene colony-forming assay kan worden ingezet om de radioprotectieve eigenschappen van een natuurlijk antioxidant te bepalen. T25-flesjes zijn vooraf gezaaid met cellen in 5 mL medium, zodat er op de dag van het experiment 1 miljoen cellen per flesje aanwezig zijn.

50 µL van het geneesmiddel wordt in verschillende concentraties toegevoegd aan de vijf ml medium in elke overeenkomstig gelabelde kolf om de gewenste concentratie te bereiken; er worden vijf concentraties gebruikt, evenals één vehikelcontrole, in dit geval PBS. Na toevoeging van het geneesmiddel worden de cellen gedurende één uur geïncubeerd onder de condities die passend zijn voor de gebruikte cellijn. Na incubatie worden de flasks, met uitzondering van de controlegroep, bestraald met de gekozen dosis, wat in dit geval vier gray is, opgewekt door een cesiumbron die gammastraling uitzendt.

Na bestraling wordt het medium afgegoten en wordt elke kolf gedurende vijf minuten gewassen met twee ml PBS. Na het afgieten van de PBS worden twee ml 0,05% trypsine aan elke kolf toegevoegd om de adherente cellen los te maken van de kolf. Vervolgens worden vijf ml DMEM met 10% foetaal runderserum aan elke kolf toegevoegd om de trypsine te deactiveren.

De volledige inhoud van de flacon wordt vervolgens overgebracht naar gelabelde Falcon-buisjes van 10 milliliter. Zodra dit is voltooid, worden deze buisjes vijf minuten gecentrifugeerd, waarna het supernatant voorzichtig wordt weggegooid zonder het pellet te verstoren, en er vijf milliliter crecy-medium aan elk buisje wordt toegevoegd. De celconcentratie voor elk monster wordt berekend, evenals het benodigde volume van elk monster om de uiteindelijke celconcentratie te bereiken die moet worden uitgeplaat in vijf petrieschalen per monster met telkens vijf milliliter medium.

Voor de controlegroep worden bijvoorbeeld 100 cellen per schaaltje geplaatst, zodat het volume dat nodig is om 500 cellen per 25 milliliter te bereiken wordt berekend; voor meer geconcentreerde monsters wordt er een 10-voudige verdunning of een 100-voudige seriële verdunning uitgevoerd om de foutmarge te minimaliseren bij het gebruik van volumes kleiner dan 100 microliters. Vervolgens wordt het eerder berekende volume klaargemaakt in een Falcon-buis met 25 milliliter medium voor elk monster. De monsters kunnen nu worden overgebracht naar eerder gelabelde schaaltjes, waarbij vijf milliliter aan elk schaaltje wordt toegevoegd voor een gemakkelijker beheer en transport.

Bewaar de schalen in een grote, steriele of gedesinfecteerde container. De schalen worden vervolgens in een bevochtigde incubator geplaatst onder de juiste omstandigheden en acht dagen geïncubeerd. Als de keratinocyten na acht dagen worden gebruikt, worden de schalen voorzichtig uit de incubator gehaald en één voor één in een zuurkast geplaatst.

Hanteer de plaat voorzichtig zodat eventuele gevormde kolonies niet worden verstoord. Verwijder de deksels en voeg vijf ml 0,9% zoutoplossing toe aan elke schaal om deze te wassen. Richt de pipetpunt naar de hoek van de schaal en vermijd contact met de bodem van de schaal, zodat kolonies niet per ongeluk worden weggekrabd.

Zuig na vijf minuten voorzichtig de zoutoplossing af. Fixeer de kolonies vervolgens met drie milliliter van de 4%-oplossing en vervang de doppen om verdamping te voorkomen. Na 15 minuten tot een half uur wordt de oplossing afgezogen en op de juiste wijze afgevoerd.

De kolonies kunnen nu worden gekleurd met 0,1% Crystal violet; er worden vijf milliliter aan elke schaal toegevoegd en de deksels worden na een halve tot een hele hour teruggeplaatst. De kleurstof wordt vervolgens weggespoeld met gedestilleerd water, waarna de schalen worden omgedraaid en een nacht worden gelaten om te drogen. De kolonies kunnen nu worden geteld.

Kolonies kunnen handmatig worden geteld met behulp van een dissectiemicroscoop. Elke cluster cellen die 50 of meer cellen bevat, wordt als een kolonie beschouwd. Hiermee is onze demonstratie van de congene survival assay voltooid.

Het belangrijkste voordeel van deze assay ten opzichte van andere technieken is dat deze ongelooflijk gevoelig is en overleving over een groot bereik kan detecteren, zelfs na zes logs celsterfte. Deze gevoeligheid wordt bereikt door grotere aantallen cellen uit te platen. Deze assay kan eenvoudig voor andere doeleinden worden gebruikt, zoals het testen van cytotoxiciteit.

Bedankt voor het kijken.