Het analyseren van de functie van kleine GTPases door micro-injectie van Plasmids in de gepolariseerde epitheelcellen

Deze procedure analyseert de effecten van kleine GTPase's op gepolariseerd membraantransport. Co-injecteer eerst DNA-plasmiden die coderen voor de kleine GTPase en de reportereiwitten in de celkernen van gepolariseerde cellen. Expressie van het DNA vindt vervolgens plaats bij temperaturen die de reportereiwitten in het endoplasmatisch reticulum of het TGN zullen vasthouden, terwijl de kleine GTPase zich ophoopt in het cytosol. Vervolgens wordt het transport van het reportereiwit naar het celoppervlak gevolgd in aanwezigheid van cycloheximide om verdere eiwitsynthese te voorkomen.

Label tot slot het reportereiwit aan het celoppervlak voor immunofluorescentieanalyse. De resultaten van deze assay maken het mogelijk om de verandering in oppervlaktelokalisatie te visualiseren via confocale microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals transfectie is dat tijdens de korte perioden van overexpressie die met micro-injectie worden bereikt, secundaire effecten minimaal zijn, waardoor we de primaire effecten van de eiwitten van belang kunnen bestuderen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de celpolariteit, zoals de manier waarop kleine gtpa gepolariseerd membraantransport reguleren. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de individuele stappen die nodig zijn voor een succesvolle micro-injectie moeilijk uit te leggen zijn zonder visuele ondersteuning. Isoleer endotoxinevrij plasma-DNA met de Sigma Aldrich endotoxin free maxi prep kit volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik voor dit experiment drie transparante transwell-filters van 12 millimeter met een poriegrootte van 0,4 micrometer voor de kweek.

Breng vier keer 10^5 MDCK-cellen aan op elk filter. Controleer na twee dagen de cultuur onder een microscoop om te verifiëren dat de cellen groeien in een gesloten monolaag. Voor micro-injectie.

Bereid op de dag van de micro-injectie platen van 360 bij 15 millimeter voor met vijf liter MM-groeimedium plus 15 millimeter heis en plaats deze in een incubator van 39 °C. Bereid daarnaast drie 12-wells platen voor met één milliliter MEM-groeimedium plus 50 millimolair heis en 0,1 mg/mL cycloheximide, en plaats deze in een incubator van 31 °C. Zet de micro-injectiemicroscoop aan; deze is geconfigureerd als een omgekeerde microscoop met een verwarmde tafel, 10x en 32x objectieven en een einor femto jet.

Stel het verwarmde platform in op 39 °C. Open daarnaast de stikstofgastoevoer naar de luchttafel. Verdun nu het DNA met gefilterd water tot een eindconcentratie van 0,2 mg/mL.

Centrifuge het DNA vervolgens in een microcentrifuge op 13.000 RPM gedurende 30 minuten. Verwijder het bovenste gedeelte en breng dit over in een nieuwe buis. Bereid vervolgens de MDCK-cellen voor door het eerste filter met een chirurgisch mesje uit de kweekschaal te halen, het filter uit de filterhouder te snijden en het in de voorbereide plaat van 60 bij 15 millimeter te plaatsen, die vijf milliliter op 39 °C voorverwarmd MEM-groeimedium plus 50 millimolair heis bevat.

Om het filter in de kweekplaat naar beneden te drukken, plaatst u het scalpelmes in het midden van het filter en brengt u vervolgens de kweekplaat over naar de verwarmde tafel van de microscoop. Laad twee tot drie µL van het verdunde DNA in een micro-injectienaald. Draai de beschermkap van de naald los en laat deze op de vloer vallen.

Om de naald in de houder te plaatsen, drukt u op de menutoets van de injector en controleert u of het ventiel gesloten is. Schroef de naald in de houder. Let erop dat u de naald niet te strak aandraait.

Om breuk te voorkomen, drukt u opnieuw op de menutoets. De toegepaste compensatiedruk voorkomt zo dat het medium in de naald wordt gezogen tijdens de microinjectieprocedure. Tik tot slot op de joystick om de opgeslagen homing-instellingen te wissen en de naald op de cellen te laten zakken.

Gebruik het 10x objectief en breng de naald in de lichtstraal boven de vloeistof. Stel nu scherp op de cellen. Stel opnieuw scherp door het scherpstelsel 180 graden omhoog te draaien en zoek de naald.

Beweeg de naald langzaam in focus. Breng hem vervolgens weer uit focus. Werk vervolgens aan het opnieuw in focus brengen van de cellen.

Breng de naald opnieuw scherp in beeld. Herhaal dit proces totdat de naald het oppervlak van het medium raakt, waarna een halo zichtbaar wordt. Ga door tot het punt waarop de cellen scherp zijn, maar de naald nog steeds onscherp is buiten het brandvlak.

Schakel nu over naar het 32x objectief en bepaal de grove instellingen. Stel de Z-limiet in door met de punt van de naald het apicale membraan aan te raken en daar ongeveer 10 micrometers van af te trekken. De kernen bevinden zich namelijk ongeveer 10 micrometers onder het apicale membraan.

Beweeg de naald nu zo snel mogelijk een paar micron uit het brandpuntvlak. Richt de naald boven de nucleus en druk op de injectieknop van de joystick en laat deze weer los. Begin bij 95 PSI om de juiste injectiedruk te bepalen.

Als de druk te hoog is, knappen de cellen open. Als de druk te laag is, blijft er een wit stipje zichtbaar, maar gebeurt er verder niets. Voer een succesvolle injectie uit waarbij een faseovergang plaatsvindt zonder dat de celgrootte verandert.

Injecteer 100 tot 500 cellen in het gat van het scalpel dat op de cellen rust. Plaats vervolgens de cellen samen met de kweekschaal en het scalpel in een incubator op 39 °C en incubeer gedurende twee uur. Transfer de cellen ten slotte naar een voorbereide 12-wells plaat met één milliliter MEM plus 50 mM 0,1 mg/mL cycloheximide en incubeer gedurende twee uur bij 31 °C.

Om bleken van het tot expressie gebrachte GFP-signaal te voorkomen, moeten de monsters tijdens alle opeenvolgende procedures voor oppervlaktekleuring tegen licht worden beschermd door ze af te dekken met aluminiumfolie. Plaats de cellen in een kweekschaal op een metalen plaat op ijs en was deze eenmaal met ijskoud PBS plus plus. Plaats een schoon stuk parafilm op de metalen plaat op ijs en pipetteer druppels van 30 µL van een antilichaam dat het ectodomein van het eiwit van belang herkent.

Plaats nu het filter met de cellen ondersteboven op de druppel en voeg een paar druppels antilichaam toe aan de achterzijde van het filter. Incubeer gedurende één uur op ijs. Was de cellen drie keer met ijskoud PBS plus plus en fixeer deze met 3% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Was de cellen eenmaal met PBS plus plus en laat ze vijf minuten equilibreren in PBS plus plus. Incubeer de cellen vervolgens in blocking permeable buffer. Incubeer één uur bij kamertemperatuur, verdun primaire antilichamen 1:200 in BPB om het tot expressie gebrachte RAB GTP ACE te detecteren, centrifugeer 10 minuten bij 13.000 RPM en pipetteer 30 µL van de antilichaamoplossing op een schoon param geplaatst in een vochtige kamer.

Plaats de cellen op het filter ondersteboven op de antilichaamdruppels en laat dit één uur incuberen. Plaats de cellen bij kamertemperatuur weer rechtop in een 12-wellplaat en was vijf keer gedurende 30 minuten met BPB bij kamertemperatuur na incubatie met de passende secundaire antilichamen, inclusief een wastap.

Dip de cellen op het filter drie keer in gedeïoniseerd water en plaats ze met de rechterkant naar boven op microscopische objectglazen met 10 µL monteermiddel. Plaats een dekglas van 18 bij 18 millimeter erop en druk het dekglas met behulp van tissues voorzichtig op de cellen. Seal dit tot slot af met nagellak in de schijninjectie van alleen het plasmide dat V-S-V-G-T-S-O 45 GFP codeert. Het eiwit wordt afgeleverd op het basolaterale oppervlak van goed gepolariseerde MDCK-cellen, zoals beoordeeld aan de rode oppervlaktekleuring in cellen die niet goed gepolariseerd zijn.

Een deel van het GFP-fusieprotein zal naar het apicale membraan worden getransporteerd. Als controlemonsters er zo uitzien, zijn de gegevens onbetrouwbaar en moet het experiment worden herhaald met beter gepolariseerde cellen. Let op dat niet alle tot expressie gebrachte GFP-fusie tijdens de chase bij 31 °C naar het basolaterale membraan wordt getransporteerd, zoals blijkt uit het uitgebreide intracellulaire groene signaal voor het totale protein. Zodra deze techniek onder de knie is, zou deze na de ontwikkeling ongeveer 10 tot 12 uur in beslag moeten nemen.

Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van membraantransport om regulatoire eiwitten in gepolariseerde epitheelcellen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht gekregen in het tot expressie brengen van eiwitten in gepolariseerde epitheelcellen met behulp van de microinjectietechniek.