Microfluïdische chip fabricage en methode om Influenza Detect
26 maart 2013
Een geïntegreerde microfluïdische thermoplastische chip is ontwikkeld voor gebruik als een moleculaire diagnostische. De chip voert nucleïnezuur extractie, reverse transcriptase, en PCR. Werkwijzen voor het vervaardigen en gebruiken van een chip worden beschreven.
Het algemene doel van het volgende experiment is om influenza A-virus te detecteren met behulp van een microfluïdische chip. Eerst wordt het monster met lysisbuffer door de SPE-kanaal geleid om het virus te lyseren en RNA te extraheren. Laad het R-T-P-C-R reagens met geëxtraheerd RNA en voer het reverse transcriptiekanaal uit om virale RNA om te zetten in CDNA. Vervolgens wordt het mengsel in het PCR-kanaal geleid om de DNA te versterken. De resultaten die worden verkregen, tonen de grootte en concentratie van het amplicon op basis van het fluorescentiesignaal van capillaire elektroforese.
Het belangrijkste voordeel van deze technologie is dat het de ruwe monsters van patiënten accepteert en het integreert de extractie van nucleïnezuur, zuivering, reverse transcriptie en versterking in een enkele chip. Om twee plaques te maken, verdeel ongeveer negen gram XN X-pellets gelijkmatig in het midden van een metalen plaat, plaats op een 198 graden Celsius verwarmde pers gedurende vijf minuten. Breng vervolgens langzaam druk aan op 2.500 PSI gedurende nog eens vijf minuten. Plaats nu een plak op de epoxy mal voorverwarmd op 157 graden Celsius gedurende 10 minuten en breng langzaam druk aan op 1000 PSI gedurende nog eens 10 minuten.
Vervolgens, draag thermische handschoenen en verwijder de plak en mal uit de hete pers en verwijder vervolgens de plak uit de mal voordat deze afkoelt. Boor drie gaten in de geëmbosseerd chip, elk op de inlaat, afvalpoort en de uitlaat van het microfluïdische kanaal. Was vervolgens de chips met IPA gevolgd door RNAs weg en dianna's water.
Laat de chips drogen met lucht om de chips eerst te verwarmen op 131 graden Celsius gedurende 10 minuten en druk vervolgens 350 PSI gedurende nog eens 10 minuten. Gebruik JB Weld Epoxy om nano poorten aan de inlaat afval en de uitlaat poorten afzonderlijk te hechten, gedurende 15 tot 24 uur. Volg de instructies van de fabrikant, spoel het SPE-kanaal met 50 microliter RNAs weg gevolgd door 100 microliter nucleasevrij water.
Laad nu het SPE-kanaal met vier microliters vers bereid graftoplossing om het methacrylaat te kruisen, incubeer gedurende 10 minuten in een UV-oven, verwijder de resterende graftoplossing met een vacuüm. Breek de opgedroogde microsfeerpellet door op de buis te tikken met het deksel gesloten. Voeg vervolgens 100 microliters verse SPE kolom oplossing toe en vortex om te mengen.
Laad vier microliters van de SPE oplossing in hetzelfde kanaal, kruisen door UV bestraling gedurende 2,5 minuten aan elke kant, resulterend in een ondoorzichtige witte gepolymeriseerde SPE kolom. Was het kanaal met 500 microliters van 100% methanol om overtollige reactanten en intrapolymeer pyrogene oplosmiddelen weg te spoelen. Bevestig twee dunne filmverwarmers aan de onderkant van de chip met thermisch geleidend plakband.
Merk op dat de zijden van de verwarmers moeten worden uitgelijnd met de rand van de brede kanalen voor Dene-duur en knielen afzonderlijk, plaats vijf thermokoppels in de chip door de doodlopende open zijkanalen van elke chiptape. Om de locatie van de thermokoppels te bepalen, voeg vier microliters van 25 XRNA toe aan 96 microliters van 70% ethanol in één buis en 100% ethanol in een tweede buis. Bereid ook 300 microliters van kanaalbuffer en 316 microliters van lysisbuffer voor.
Verwarm de oplossingen gedurende 15 minuten op 60 graden Celsius. Om de RNA-beveiliging te activeren, vervolgens om het microfluïdische kanaal in evenwicht te brengen. Laat de kanaalbuffer met een stroomsnelheid van 0,8 milliliter per uur door het SPE-kanaal lopen.
Nu snel fava-testmonster in VTM bij 37 graden Celsius. Verwijder het monster zodra het is ontdooid. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 13.000 RPM.
Breng 100 microliters van het supernatant over in 300 microliters van de lysisbuffer en voeg zes microliters van één microgram per microliter drager, RNA toe om te vortexen. Draai vervolgens gedurende vijf seconden en laad het volledige lysaat in een lure lock één CC-sering. Laat het lysaat met een stroomsnelheid van 0,8 milliliter per uur door het SPE-kanaal lopen.
Was vervolgens het SPE-kanaal met 100 microliters 70% ethanol, gevolgd door 100 microliters 100% ethanol met een snelheid van één milliliter per uur. Plaats een lege spuit op de 0,5 milliliter markering en duw lucht door het kanaal om het te drogen met een snelheid van één milliliter per uur. Laat vervolgens 67,5 microliters nucleasevrij water door het kanaal lopen om de gebonden nucleïnezuren te elueren met een snelheid van 0,5 milliliter per uur en verzamel 13,5 microliters van de nanopoort bij de afvalpoort.
Laad 36,5 microliters van de R-T-P-C-R master. Mix in de nanopoort bij de afvalpoort en mix met sjabloon RNA voor een 50 microliter R-T-P-C-R reactie. Laad vervolgens het R-T-P-C-R mengsel in het RT-kanaal door middel van een zachte vacuüm.
Versluit de nanopoort met een gesloten fitting. Breng 35 volt aan op verwarmer één. Houd de reagentia in het RT-kanaal gedurende 30 minuten nadat verwarmer één in evenwicht is gebracht op 50 graden Celsius.
Houd de reagentia in het RT-kanaal gedurende 15 minuten nadat verwarmer één in evenwicht is gebracht op 95 graden Celsius. Breng vervolgens 27 volt aan op verwarmer één en 50 volt op verwarmer twee om verwarmer één op 60 graden Celsius en verwarmer twee op 95 graden Celsius in evenwicht te brengen. Duw de reagentia in het PCR-kanaal met een snelheid van 0,5 microliter per minuut.
Ongeveer 20 minuten later, wanneer de reagentia het einde van het serpentinekanaal naderen, verzamel de PCR-producten bij de uitlaat met behulp van een geschikt gedimensioneerde pipet en tip voor de Agilent hoge gevoeligheid DNA-test. Verwij
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een geïntegreerde microfluïdische thermoplastische chip die is ontworpen voor moleculaire diagnostiek, specifiek voor het detecteren van het influenzavirus A. De chip maakt nucleïnezurextractie, reverse transcriptie en PCR-amplificatie mogelijk in een gestroomlijnd proces.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Microfluïdica
- Moleculaire diagnostiek
- Virologie
Achtergrond
- Microfluïdische apparaten hebben het potentieel om diagnostische processen te revolutioneren.
- Efficiënte extractie en amplificatie van nucleïnezuren zijn cruciaal voor een nauwkeurige virale detectie.
- De integratie van meerdere stappen op één chip verbetert de bruikbaarheid en vermindert de risico's op contaminatie.
- Deze technologie maakt het gebruik van ruwe patiëntenmonsters mogelijk, waardoor de workflow wordt vereenvoudigd.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een microfluidische chip die extractie, zuivering, reverse transcriptie en amplificatie van nucleïnezuren integreert.
- Het demonstreren van de effectiviteit van de chip bij het detecteren van het influenza A-virus.
- Het bieden van een gedetailleerde methodologie voor de fabricage en bediening van de chip.
Gebruikte methoden
- Lysis van de monsters met een buffer om RNA uit het virus te extraheren.
- Toevoegen van het geëxtraheerde RNA aan de reagentia voor reverse transcriptie-PCR (R-T-P-C-R).
- Uitvoeren van het reverse transcriptie-kanaal om viraal RNA om te zetten in cDNA.
- Amplificatie van het DNA in het PCR-kanaal en analyse van de resultaten via capillaire elektroforese.
Belangrijkste resultaten
- De chip detecteert met succes influenza A-virus uit ruwe patiëntenmonsters.
- De resultaten geven de grootte en concentratie van het amplicon aan op basis van fluorescentiesignalen.
- De geïntegreerde aanpak vermindert de noodzaak voor meerdere afzonderlijke procedures.
- Fluorescentieanalyse bevestigt de effectiviteit van het amplificatieproces.
Conclusies
- De microfluïdische chip vertegenwoordigt een aanzienlijke vooruitgang in de moleculaire diagnostiek.
- Het stroomlijnt het detectieproces voor het influenzavirus A.
- Deze technologie zou in de toekomst kunnen worden aangepast voor andere virale pathogenen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Geïntegreerde microfluidische diagnostiek stroomlijnt de detectie van infectieziekten door nucleïnezuurextractie, amplificatie en analyse te consolideren op een enkel platform. Deze aanpak verbetert het voorspellende vertrouwen en de operationele efficiëntie op de kritieke interface tussen monsterneming en moleculaire uitlezing. De technologie ondersteunt een snelle, schaalbare inzet voor pathogeensurveillance over de gehele portfolio en validatie van targets in een vroeg stadium.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe analyse van klinische monsters mogelijk voor de aanwezigheid van pathogenen en nucleïnezuursignaturen.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door lysis, zuivering en amplificatie te integreren in een gesloten systeem.
- Faciliteert snelle hypotheseonderzoeken naar infectieziektedoelen met behulp van materiaal afgeleid van patiënten.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde nucleïnezuurmonsters voor voor downstream moleculaire assays en screeningsworkflows.
- Standaardiseert de monsterverwerking om de reproduceerbaarheid en de consistentie van de kwantitatieve output te verbeteren.
- Maakt high-throughput assay-ontwikkeling mogelijk door handmatige interventie en het risico op contaminatie te verminderen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijst diagnostische outputs af met translationele biomarkerstrategieën voor programma's voor infectieziekten.
- Biedt continuïteit van de acquisitie van klinische monsters tot de validatie van preklinische modellen.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door het leveren van robuuste, kwantitatieve moleculaire gegevens.
Integratie van pijplijn en workflow
Dit microfluïdische platform slaat een brug tussen vroege ontdekking en translationeel onderzoek door directe, kwantitatieve analyse van patiëntenmonsters op virale nucleïnezuren mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Integreert hypothese-gestuurde pathogeendetectie met mechanische risicoreductie in één enkele workflow.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve nucleïnezuuroutputs die geschikt zijn voor assay-standaardisatie.
- Analytics: Biedt read-outs op basis van capillaire elektroforese voor nauwkeurige amplicon-sizing en concentratiemeting.
- Translationeel Onderzoek: Faciliteert de afstemming van diagnostische outputs op klinische biomarkervereisten.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een modulair platform dat aanpasbaar is aan nieuwe pathogenen door het reagensontwerp te wijzigen.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid en vermindert ambiguïteit in workflows voor pathogeendetectie.
- Operationele waarde: Stroomlijnt sample-to-answer processen, waardoor de handmatige tijd en het risico op fouten worden geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Versnelt go/no-go beslissingen voor programma's voor infectieziekten en ondersteunt schaalbare implementatie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van diagnostische en therapeutische kandidaten voor meerdere pathogenen mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microfluidische fabricage en optimalisatie van moleculaire assays.
- Vereist toegang tot thermische controlesystemen, spuitpompen en instrumentatie voor capillaire elektroforese.
- Vereist strikte standaardisatie tussen teams voor de chipvoorbereiding en analytische protocollen.
- Aanpassing aan nieuwe pathogenen hangt af van het herontwerp en de validatie van reagentia.
- Doorvoersnelheid en schaalbaarheid worden beïnvloed door de chipfabricage en de integratie van randapparatuur.
