Een microfluïdische apparaat met Groove patronen voor het bestuderen van Cellular Gedrag

Mijn naam is Jiang, ik ben een poster-fellow aan Harvard en MIT, Health Sciences and Technology. Mijn expertise in dit lab bestaat uit het genereren van innovatieve microfluidische apparaten om cellulair gedrag te bestuderen. Ik kan zeer vernieuwende gradiëntapparaten ontwikkelen, evenals geïntegreerde microfluidische apparaten.

Het TC-apparaat kan de cel-celinteractie en celinteractie, evenals het contact met de cel-solarfactor, nauwkeurig manipuleren. Met het TC-systeem kan ik fundamentele celbiologie bestuderen en toepassen binnen de ontwikkelingsbiologie en de bio-stamcelbiotechnologie. Mijn naam is Amir Manchi en ik ben een undergraduate student in het lab van professor Haan aan de Harvard, MIT Division of Health Sciences and Technology.

Ik heb gewerkt aan microfluïdische apparaten en we hebben geprobeerd als bewijs van concept aan te tonen dat microfluïdische apparaten zeer potentieel zijn voor het kweken van cellen en het uitvoeren van verschillende onderzoeken, zoals toxiciteitsstudies. Daarnaast hebben we geprobeerd de vloeistofkarakteristieken binnen deze apparaten te bestuderen en te optimaliseren als functie van stroomsnelheden, geometrie en andere parameters. We beginnen nu in de ruimte voor microfabricage en wat we gaan doen, is het maken van enkele microfluïdische apparaten; om deze microfluïdische apparaten te realiseren, hebben we patronen op silicon wafers en PDMS-mallen daarop nodig. Dit PDMS-polymeer is in feite een mengsel van twee verschillende componenten.

Het is een mengsel van een siliconen elastomerbasis en een siliconen elastomerharder. We mengen deze twee in een verhouding van 10 op 1, dus 10 delen basis en één deel harder. Ik neem nu ongeveer 20 gram van de basis.

Ik heb daarnaast twee gram van het hardingsmiddel nodig en het hardingsmiddel heeft een veel lagere dichtheid. Het zal veel sneller stromen en ik moet voorzichtig zijn. Het is nu ongeveer 22 uur en ik wil de basis en het hardingsmiddel met elkaar mengen.

Daarom gebruik ik een pipet om dit te doen. Ik zal proberen het zo goed mogelijk door elkaar te mengen. Vervolgens giet ik dit PDMS-polymeer over de siliciumwafers die reeds een patroon aan de bovenzijde hebben; de siliciumwafer helpt bij het overbrengen van het patroon op de PDMS-mallen.

U kunt zien dat ik hier twee siliciumwafers heb; de reden hiervoor is dat de ene bedoeld is voor de bovenlaag van ons microfluïdische apparaat en de andere voor de onderlaag. We hebben twee lagen nodig in microfluïdische apparaten omdat we een kanaal willen creëren en het hele doel van microfluïdische apparaten is om een stroming in deze kanalen te genereren. Daarom moet ik dit mengsel over beide siliciumwafers gieten, omdat er veel bellen in dit mengsel zitten.

Ik wil deze bellen verwijderen en dat doen we door vacuüm te gebruiken om die bellen eruit te halen. We zijn terug in het hoofdlaboratorium en, zoals ik eerder al zei, zitten er veel bellen in het PDMS-mengsel die we willen verwijderen. Ik ga de mengsels op de siliciumwafers in de vacuümkamer plaatsen. Ik sluit de kamer en zet het vacuüm aan; wanneer dit klaar is, plaatsen we de PDMS-mallen een nacht in een oven om ze verder uit te harden.

We bevinden ons nu in het laboratorium en we gaan deze microfluidische apparaten assembleren. We nemen de PDMS-mallen, die een nacht in de incubator hebben gestaan en waarin de patronen van de siliciumwafers zijn gevormd; ik ga twee verschillende patronen gebruiken. Aan de linkerkant ziet u het microkanaal, dat de bovenste laag zal vormen, en aan de rechterkant ziet u enkele groene lijnpatronen, die de onderste laag zullen vormen.

En dit zal de groeven in het microapparaat vormen. Ik begin met het doorsnijden van deze gels, zodat de bovenste laag gemakkelijk van de siliciumwafer kan worden gescheiden. Vervolgens breng ik deze met de voorkant naar boven over naar deze petrischaal, zodat de patronen naar boven gericht zijn.

Vervolgens ga ik hetzelfde doen voor de groeven, wat de groene lijnpatronen zijn. Deze zullen de onderste laag vormen. Zodra de gel is uitgesneden, zal ik deze overbrengen naar de petrischaal en ik ga ze afplakken om te voorkomen dat er stof op de patronen terechtkomt.

De volgende stap is het ponsen van de uiteinden van de kanalen om cellen en medium naar binnen en buiten te laten stromen. Omdat ik hier een breed oppervlak heb en de patronen zelf niet kan zien, zal ik dit gebruiken om de kanalen zichtbaar te maken en zal ik beide uiteinden ponsen. Ik pons hier een groot gat, zodat er een reservemarge is, en aan de andere kant pons ik een klein gaatje om polyethyleen slangjes aan die zijde te kunnen gebruiken.

We bevinden ons nu in de ruimte voor microfabricage en de volgende stap is het hechten van de twee verschillende oppervlakken die we hebben. Hiervoor gebruikt u deze machine, die een plasmareiniger wordt genoemd, en het proces heet plasmabehandeling. Wat er in deze kamer gebeurt, is dat er een plasmaomgeving wordt gecreëerd, waarbij de interactie tussen het plasma en het oppervlak de zwakke oppervlaktebindingen verbreekt en deze vervangt door zeer reactieve chemische groepen.

Wat we nu gaan doen, is dat ik de tapes verwijder die hier zijn aangebracht om stof te voorkomen, waarna ik deze mallen in de kamer zal plaatsen. Ik sluit de deur volledig, zet eerst de stroom aan en daarna de pomp, waarna we klaar zijn om te beginnen. We gaan hier over vijf tot 10 minuten op terugkomen.

Nu wil ik het uitschakelen, dus ik zet de pomp en de stroom uit en open vervolgens de kamer. Er is hier eigenlijk een onderdruk, dus u hoort mogelijk een geluid. Dat komt door de onderdruk, dus ik haal mijn vormen langzaam eruit.

Aangezien beide patroonoppervlakken naar boven zijn gericht, neem ik de onderste laag in mijn linkerhand, keer ik de bovenste laag om en plaats ik deze bovenop mijn groeven, om vervolgens de lagen op elkaar te drukken. De hechtsterkte en permanentie vormen het voordeel van het gebruik van deze plasmabehandelingsmachine. Wat u hier nu ziet, is dat u daadwerkelijk het kanaal op de bovenste laag en de gegroefde patronen op de onderste laag kunt zien, en het geheel is nu klaar voor de volgende stap.

Breng vervolgens deze kweekruimte en dit kweekmedium hiernaartoe en open de schaal. We kunnen nu het fibronectine laden: neem 60 µL fibronectine en breng dit over in het apparaat. Om een stroming in het apparaat te genereren en zo een dunne coating van het fibronectine binnenin het kanaal te induceren, kunnen we voorzichtig aan de uitlaat zuigen.

Daarna kunnen we dit apparaat in de incubator plaatsen voor één uur. Na één uur koelen door de vibratie in de incubator, halen we de monsters uit de incubator. Vervolgens gebruiken we drie fiber rust voor de fusie en disshade, voegen we het medium toe en bepalen we de celconcentratie met behulp van een celteller.

Normaal gesproken gebruiken we ongeveer een miljoen cellen die in het apparaat zitten. Na de dissociatie kunnen we een paar keer met de spoelvloeistof spoelen, vervolgens de celsuspensie opnemen en deze in het kanaal laden. Om de cellen beter in het kanaal te laden, kunt u voorzichtig vloeien met behulp van de aspirator.

Het supernatant en de oppervlaktesuspensie worden doorgaans automatisch via de uitlaatcel afgezogen, waardoor de selectieve, globale kanaal wordt gezaaid. Daarna kunnen we het geheel demonteren en één uur in de incubator plaatsen, totdat de cellen volledig verspreid zijn in het kanaal. Vervolgens kunnen we annexine V en propidiumjodide, evenals waterstofperoxide, infuseren.

Bestudeer vervolgens uw assay voor de tijdshypothese. We kunnen de monstername uitvoeren in een kweekmedium voor weefselculturen en vervolgens een oplossing maken van 2 mL DMM-medium, evenals 20 µL annex five, 40 µL propiodine en 100 mU waterstofperoxide. Neem vervolgens de 2 mL medium met annex five, propiodide en waterstofperoxide en plaats daarna de spuit.

Voeg de twee mill media en annex five prop iodide, hydro perside toe. We kunnen de oplossing in de syringes plaatsen, vervolgens de belletjes verwijderen en daarna de C bear aansluiten. Dit zijn gasdichte Hamilton warm mill syringes.

Deze is drie beren. Deze is wegwerpplafonds. Deze is een naald van 27 gauge.

Dit is PE 20 poly-tubing. Nadat de oplossing in een spuit is geladen, kunt u deze volledig uitdrukken en herhalen, en vervolgens soms op de spuit tikken om de belletjes te verwijderen en de oplossing weer op te zuigen. Druk het geheel nogmaals volledig uit, verwijder de luchtbel en vul de spuit daarna voorzichtig opnieuw.

Neem de oplossing voor één maaltijd en schakel vervolgens de klep om. Duw de oplossing door de driewegkraan en volledig in de slang. De oplossing komt uiteindelijk uit de punt van de slang, waarna we de slang kunnen aansluiten op het micro-apparaat en kunnen beginnen met het infuseren van 1 µL per minuut.