Een microfluïdische apparaat voor het bestuderen van meerdere, afzonderlijke stammen

Het algemene doel van de volgende methode is om het gedrag van individuele cellen van verschillende giststammen onder dezelfde dynamische omstandigheden in beeld te brengen. Dit wordt bereikt door het vervaardigen van een microfluïdisch apparaat met twee lagen, waarbij de onderste laag elke verschillende stam afzonderlijk bevat en de bovenste laag in een tweede stap de dynamische stroomcondities verzorgt. Verschillende giststammen worden in de putjes geplaatst en het apparaat wordt gesloten, waardoor een enkel kanaal met meerdere gescheiden stammen ontstaat.

Vervolgens beelden we de cellulaire respons op dynamische mediumwijzigingen in. Door de stroomsnelheden in de twee ingangen van het Y-kanaal te regelen, tonen de resultaten verschillende stammen die aan dezelfde dynamische condities zijn blootgesteld, zonder kruiscontaminatie tussen de putjes. Dit microfluïdische apparaat biedt verschillende belangrijke voordelen ten opzichte van andere bestaande systemen. Het maakt het mogelijk om meerdere verschillende stammen onder dezelfde dynamische condities in beeld te brengen.

Bovendien kan het eenvoudig in elk laboratorium worden geproduceerd zonder dat speciale apparatuur nodig is. Deze methode is voortgekomen uit discussies over hoe de reacties van verschillende wilde isolaten uit het Oosten op uithongeringspassages konden worden gevolgd. Begin met het tekenen of uitprinten van de gewenste microkanaalindeling op schaal.

Bedek vervolgens een glazen objectglas met lagen plakband. Om de gewenste hoogte van het kanaal te bereiken, plaatst u het ontwerp op een vlakke ondergrond en lijnt u het objectglas uit over het ontwerppatroon. Snijd nu voorzichtig het plakband op het objectglas uit volgens het ontwerp. Verwijder het plakband van alle delen van het objectglas.

Accepteer deze in de lay-out van het microkanaal. Plaats het objectglas gedurende drie minuten in een warmteoven van 65 °C. Reinig vervolgens voorzichtig met ethanol.

Meng de basis- en uithardingscomponenten van PDMS volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Giet ongeveer 30 milliliters van het PDMS-mengsel in een Petrischaal tot een hoogte van ongeveer 0,5 centimeters. Ontgas het PDMS in vacuüm indien nodig.

Dompel het glazen dekglas in de PDMS, waarbij de gepatroneerde scotch tape naar boven is gericht. Door het patroon pas na de PDMS te plaatsen, wordt de vorming van luchtbellen tussen het dekglas en de bodem van de schaal voorkomen. Giet drie milliliters PDMS-mengsel in een nieuwe Petri-schaal van 90 millimeter. Laat dit 48 uur uitharden bij 65 °C, waarbij met een waterpas wordt gecontroleerd of de schaal horizontaal staat.

Deze stap kan worden uitgevoerd op een spin-coder indien beschikbaar. Voer de DGAs en het uitharden uit zoals eerder getoond. Snijd nu voorzichtig de stroomlaag van het microfluïdische apparaat op de gewenste maat uit met een biopsietpons.

Maak gaten voor de in- en uitlaten in de stroomlaag. Snijd daarnaast een laag met putjes van een vergelijkbare grootte uit de tweede Petrischaal en plaats deze op een dikke glasplaat. Schuif het ontwerpoverzicht eroverheen.

Stans vervolgens gaten in overeenstemming met de microkanalen op de lay-out met behulp van ethanol, maak beide PDMS-lagen en een glazen dekglas schoon en laat deze aan de lucht drogen. Behandel vervolgens het glazen dekglas en de PDMS-laag met gaten met ofwel een standaard plasma-etser voor irreversibele hechting, of een handcorona-behandelaar voor reversibele hechting. Plaats de laag met gaten voorzichtig op het dekglas om hechting te bewerkstelligen.

Wrijf voorzichtig eventuele luchtbellen weg. Bereid het gewenste medium voor in geschikte spuiten en sluit deze aan op tigon-slangen die door een spuitenpomp zijn geregen. Voor celbeeldvorming.

Gebruik strengths. Ga naar de gewenste fase, vortex de cultuur grondig en breng 300 µL over in microcentrifugebuisjes. Plaats voorzichtig 1 µL con canna A in elke put van de PDMS-putlaag.

Spoel het overschot aan concanavaline A uit elke put twee keer uit door voorzichtig water te pipetteren terwijl de concanavaline A droogt. Was de stammen twee keer met 300 µL SC-medium zonder glucose. Het uitwassen van residuele glucose van de celwanden helpt bij een goede hechting aan de concanavaline A.

Pipette na het vortexen ongeveer 0,5 µL van de celsuspensie grondig in individuele putjes. Spoel resterende cellen voorzichtig weg met rijk medium. De volgende twee stappen moeten snel worden uitgevoerd om te voorkomen dat de cellen uitdrogen.

Behandel als optionele stap de chip en de putjes met plasma, waarbij u voorzichtig bent om de putjes niet rechtstreeks te raken. Plaats de chip vervolgens onder een stereoscoop zorgvuldig op de putjes, waarbij u nauwgezet let op de uitlijning tussen beide. Druk zachtjes aan om de twee PDMS-lagen te laten hechten.

Vul het apparaat langzaam volledig met ongeveer 50 µL rijk medium, waarbij u ervoor zorgt dat er geen luchtbellen in het kanaal achterblijven. Sluit het apparaat nu aan door de slangen in de juiste inlaatopeningen te plaatsen en start de mediastroom. Let erop dat er geen luchtbellen in de slangen ontstaan, aangezien deze vast kunnen komen te zitten in het apparaat en de stroom kunnen verstoren.

Plaats het apparaat vervolgens onder een microscoop en bepaal in elke well geschikte beeldenpunten. Houd de cellen gedurende één uur, of indien nodig langer, onder een rijke mediumstroom om herstel mogelijk te maken.

Start het experiment met een constante stroomsnelheidinstelling. Stel pomp A in op 0,8 milliliters per uur en pomp B op 0,2 milliliters per uur. Voor het medium moet de stroming over 80% van de breedte van het kanaal lopen.

We kunnen de condities in het apparaat dynamisch wijzigen door de relatieve stroomsnelheden aan te passen. De nieuwe condities stabiliseren binnen enkele seconden over het gehele kanaal. Om de scheiding tussen verschillende stammen aan te tonen, worden twee onderscheidbare giststammen in afwisselende putjes afgebeeld.

Let op dat er in dit experiment geen lekkage van cellen tussen de putjes plaatsvindt. Beide stammen beschikken over de transcriptiefactor MSN twee getagd met YFP om het gelijktijdige effect van dynamisch veranderende condities te testen. De stroomsnelheden in de twee ingangskanalen zijn gewijzigd om een stap van glucosevrij medium te creëren.

Dit resulteerde in lokalisatie van MSN twee tot de nucleus. Belangrijk is dat het tijdverloop van de nucleaire MSN twee YFP-niveaus in individuele cellen geanalyseerd kan worden. De PDMS-microfluïdische chip kan dus worden gebruikt voor het toepassen van gelijktijdige dynamische condities op meerdere putjes.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de cellen niet uitdrogen tijdens de assemblage van het apparaat. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze eenvoudig worden uitgevoerd zonder dat soft-lithografie nodig is.